野菊花提取物對牙齦卟啉單胞菌胰酶樣蛋白酶活性的抑制作用

陳春雨，劉 鶴，何 畔，盧建忠，應 頔，馬 寧

（吉林大學口腔醫院牙周病科，吉林 長春 130021）

野菊花是野菊的頭狀花序，野生資源非常豐富。以往對野菊花抑菌的臨床研究較為多見，其主要用于抑制引起機體感染和疾病的病原真菌。有研究［1－2］表明：野菊花中主要含黃酮、萜類和揮發油等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化以及免疫調節等作用。被稱為 “廣譜抗生素”的野菊花是一種理想的安全性很高的藥食同源的植物。牙齦卟啉單胞菌 （Porphyromonas gingivalis，P.g）是革蘭陰性無芽孢球桿菌，是牙周病、尤其是慢性牙周病病變區或活動部位最主要的優勢菌，與牙周炎治療后復發及病情加重有關。在P.g眾多的毒力因子當中，胰酶樣蛋白酶 （trypsin－like protease，TLP）的活性較高，是P.g最重要的毒力因子之一，通過多種途徑破壞牙周組織［3］。牙周病的治療藥物應有效地抑制牙周致病菌，目前對野菊花對牙周病治療作用機制國內外尚無相關報道。本實驗通過研究野菊花提取物對P.g的最小抑菌濃度及其對P.g生長的影響，探討野菊花提取物對牙周致病菌的抑制作用及對牙周炎的治療作用，以期為野菊花成為治療牙周病藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 P.g ATCC33277由本院牙周病科提供。將－80℃保存的P.g ATCC33277于常溫下解凍后，接種于血瓊脂平板上，在37℃厭氧條件下培養48h后傳代，經染色及鏡下形態學觀查確定其為純培養后，采用麥氏比濁法用磷酸鹽緩沖液 （PBS，pH 7.2）配制成 P.g 細菌懸濁液（108CFU·mL－1）備用。

1.2 主要試劑和儀器 牛心腦浸液培養基 （BHI培養基，5mg·L－1），0.2mmol·L－1苯甲酸－L－精氨酸對硝基苯胺（Na－Benzoyl－L－Arginine－PNitroanizide，BAPNA， 美國Sigma 公司 ），10mmol·L－1二硫基蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT，美國Setra公司），2500U·mg－1標準胰蛋白酶 （trypsin，上海甄準生物科技有限公司），0.1%Triton X－100 （Por－analysi，德國Merck公司），50mmol· L－1Tris－HCL （PH 7.5），0.01%G－250考馬斯亮藍染色液，標準牛血清白蛋白，PBS緩沖液 （PH 7.2）。722型紫外分光光度計和厭氧培養箱 （上海龍躍公司），低溫冷凍高速離心機中離心 （長沙）。

1.3 野菊花提取物配制提取物 前期實驗得出野菊花提取物對P.g最小抑菌濃度為1.250g·L－1，本實驗為測野菊花提取物對P.g的TLP活性的影響，所以選擇低于最小抑菌濃度的濃度值，并采用對倍稀釋法將野菊花提取物配制成0.6250、0.3125和0.1563g·L－1。

1.4 細菌培養和處理 取2mL EP管5個，分為5組，每組另設5個平行管：其中3個平行管作為實驗組，加入野菊花提取物系列稀釋液，分別為低、中和高濃度野菊花提取物組 （采用對倍稀釋法，選取小于最小抑菌濃度的3個濃度梯度）；陰性對照組加入低濃度野菊花提取物，不加P.g；陽性對照組不加野菊花提取物。在上述5組EP管中分別加入BHI培養基，P.g菌懸液，PBS緩沖液。低、中和高濃度野菊花提取物組及陰性對照組加入野菊花提取物0.5mL。將上述EP管在厭氧箱中37℃培養48h。

肉眼見細菌生長，并在鏡下經形態學鑒定為純P.g培養物后，將EP管置于低溫冷凍高速離心機中離心 （13000r·min－1、4℃）6min，收集上清液 （培養物上清液）備用。收集離心后剩余的菌細胞，經PBS洗滌3次，用PBS配成P.g菌懸液，進行超聲破碎 （10Hz，冰浴0～4℃，破碎5s，休息10s，重復6次），直到鏡下見菌細胞完全破碎為止，將上述破碎后的菌懸液置于低溫冷凍高速離心機中再次離心 （13000r·min－1、4 ℃）6min，收集上清液 （菌細胞破碎后上清液）備用。

1.5 TLP活性的測定 取1塊96孔板 （每孔容積350μL），選其中14孔作為標準孔，分為7組，每組2孔，其中2孔為空白孔和5孔為實驗孔。實驗孔按野菊花提取物濃度不同分為低、中、高濃度野菊花提取物組、陰性對照組和陽性對照組，每組2孔。分別在標準孔、空白孔、實驗孔中加入140μL Tris－HCL、100μL BAPNA、10μL DTT和10μL TritonX－100后，將96孔板放入溫度為37℃的THZ－C型恒溫振蕩器中振蕩10min，使混合液充分混勻，取出96孔板，在空白孔中加入30μL Tris－HCL （標準胰蛋白酶濃度為0U·mL－1），在實驗孔中分別加入30μL培養物上清液和30μL菌細胞破碎后上清液，再將反應板放入溫度為37℃的THZ－C型恒溫振蕩器中振蕩15min，使其充分反應，取出96孔板在紫外光分光光度計下測定每孔液體的吸光度 （A）值 （λ＝405nm），空白孔用于調零。用同樣方法制備胰蛋白酶標準曲線，只是在標準孔中加入30μL經系列稀釋的標準胰蛋白酶 （濃度0～8000U·mL－1），以標準孔中胰酶活性單位為橫坐標，其A值為縱坐標，做出胰酶樣蛋白酶的標準曲線，以實驗孔中2種上清液的A值在標準曲線上的投射點算出其橫坐標值，即TLP活性值。

1.6 上清液中蛋白濃度的測定 取1塊96孔板（每孔容積350μL），選其中7孔為標準孔，2孔為空白孔，實驗孔則按野菊花提取物濃度不同分成5組，其中包括陰性對照組和陽性對照組，每組為2孔。在空白孔中加入10μL PBS緩沖液 （牛血清白蛋白濃度為0g·L－1）、實驗孔中分別加入10μL培養基上清液和菌細胞上清液。然后在每個反應孔中分別加入280μL考馬斯亮藍G－250染色液，室溫反應2min并震蕩10s，之后在紫外光分光光度計下采取比濁法測定蛋白濃度的A值 （λ＝405nm），空白孔用于調零。采用同樣方法制備牛血清白蛋白標準曲線。不同的是在標準孔中則分別加入10μL牛血清白蛋白溶液 （對倍稀釋7個濃度梯度，0～6.25g·L－1）。以標準孔中牛血清白蛋白濃度為橫坐標，其A值為縱坐標，作出標準曲線。以實驗孔中2種上清液的A值在標準曲線上的投射點，計算出其橫坐標值，即蛋白濃度（g·L－1）。

1.7 TLP比活的測定 以實驗孔中TLP的活性值除以其所含的蛋白濃度表示每克蛋白所含的TLP的活性單位，即比活。

1.8 統計學分析 采用SPSS 11.5統計軟件對數據進行統計學分析。各組上清液中TLP活性、蛋白水平和TLP比活以表示，組間比較采用單因素方差分析。以α＝0.05為檢驗水準。

2 結 果

與陽性對照組比較，中、高濃度野菊花提取物組上清液中TLP活性 （游離態和結合態）均降低（P＜0.05）；與低濃度野菊花提取物組比較，中、高濃度野菊花提取物組上清液中TLP活性 （游離態和結合態）均降低 （P＜0.05）；與中濃度野菊花提取物組比較，高濃度野菊花提取物組上清液中TLP活性 （游離態和結合態）均降低 （P＜0.05）。各組上清液中蛋白水平和TLP比活無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1 各組上清液中TLP活性、蛋白和TLP比活Tab.1 Activities of TLP，levels of proteins and TLP specific activities in supernatant fluid in various groups （）

表1 各組上清液中TLP活性、蛋白和TLP比活Tab.1 Activities of TLP，levels of proteins and TLP specific activities in supernatant fluid in various groups （）

＊ P＜0.05 vs positive control group；△ P＜0.05 vs low concentration of wild chrysanthemum extract group；#P＜0.05 vs medium concentration of wild chrysanthemum extract group.“－”：No data.

Group TLP activity［λB／（U·mL－1Protein［ρB／（g·L－1 ernatant Negative control － － － －Positive control 5332.39±47.27 7562.38±35.37 0.35±0.25 0.3500±0.21 Wild chrysanthemum extract Low 4879.73±38.34 6254.67±69.74 0.32±0.15 0.3096±0.10 Medium 2764.54±25.79＊△ 3887.49±46.20＊△ 0.21±0.20 0.2247±0.20 High 1487.81±34.63＊△#2638.25±73.21＊△# 0.14±0.21 0.1950±0.15 Group TLP specific activity［λB／（U·mg－1 ernatant Negative control －）］Culture supernatant Fragmentation sup－Positive control 15478.45±536.35 21646.73±386.34 Wild chrysanthemum extract Low 15296.57±565.60 20245.42±734.59 Medium 12984.76±428.97 17328.93±530.96 High 10788.50±364.90 13592.89±685.04）］Culture supernatant Fragmentation supernatant）］Culture supernatant Fragmentation sup

3 討 論

目前，牙周病主要治療手段是牙周基礎治療輔以抗生素，但抗生素副作用較大，會使細菌產生耐藥性，影響治療效果。因此，國內外學者均致力于研究一種新的藥物來抑制牙周致病菌。而中藥應用方便、吸收快捷、藥效明顯、不易產生耐藥性，使其成為近年來的研究熱點。張紅梅等［4］采用液體二倍稀釋法研究發現：五倍子水提物能夠抑制P.g的生長及其毒力作用。左渝陵等［5］利用熒光分光光度計檢測熒光底物的降解發現：骨碎補水提物能有效抑制P.g的TLP活性，其抑制作用能降低細菌的生長，減緩牙菌斑的形成。毛勝鳳等［6］采用菊米（野菊花的花蕾或花蕊）和成熟期的野菊花，通過瓊脂平板培養法觀察細菌的生長情況并進行比較發現：菊米和成熟期的野菊花對枯草桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均較其對青霉等霉菌及啤酒酵母的抑菌效果明顯，其中對大腸桿菌的敏感度最高。但菊米較成熟期野菊花的抑菌效果更明顯。胡浩斌等［7］采用野菊花揮發油通過體外實驗證明：野菊花對金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、大腸桿菌、結核桿菌和白色念球菌有一定程度的抑制作用，尤其是揮發油醇稀釋液致使白色念球菌在體外不生長，并且揮發油的醇稀釋液的抑菌效果優于醚的稀釋液。溶解于不同稀釋液所產生的不同抑菌效果為野菊花中有效成分的提取及相關藥物的研發提供了理論依據。

野菊花具有抑菌活性已是公認的事實。而且野菊花在我國各地分布廣泛，被稱為中草藥中的 “廣譜抗生素”，更具有臨床意義。但應用野菊花作用于P.g的研究尚未見報道。在我國豐富的中藥資源中，野菊花分布廣泛，原料易得，已廣泛應用于食品安全和醫療保健等領域。魏艷等［8］采用柱層析和薄層層析技術從野菊花中提取到的刺槐素7－蕓香糖苷，對其進行殺菌活性測定，證明其可以抑制蘋果腐爛病菌的生長；野菊花的醫藥保健價值較高，在心血管疾病治療中有血管舒張作用［9］；此外，野菊花提取物能夠通過抑制人肝癌細胞有絲分裂對肝腫瘤細胞的生長起抑制作用［10］，且可以將其用于治療感染性疾?。?1］和病毒性疾?。?2］。野菊花藥效溫和持久，對組織刺激性小，安全無毒副作用，細菌不易產生耐藥性，不會引起長期使用抗生素產生的菌群失調，用其治療牙周炎將拓展牙周用藥范圍并實現其藥用價值。P.g是公認的牙周致病菌之一，在牙周病的發生發展過程中起重要的作用［13－14］。P.g可以產生多種毒力因子，其中 TPL是其分泌的主要毒力因子之一，是導致慢性牙周病的主要因素之一［15］。TLP還能降低抗體的調理作用，抑制免疫反應，導致牙周炎炎癥過程中齦溝液的滲出，降低牙周組織局部的免疫功能［16］。

本實驗測定了菌細胞破碎后上清液中TLP活性即與菌細胞結合的結合態TLP活性及培養物上清液中的TLP活性 （細菌分泌到培養物中呈游離態的TLP活性）。本研究結果顯示：在未加野菊花提取物時，P.g培養物上清液中結合狀態的TLP活性比游離態高，說明TLP主要結合于P.g細胞膜表面；結合態的TLP比活高于游離態，說明結合態TLP水解蛋白的能力強于游離態。本研究結果顯示：中、高濃度野菊花提取物組和陽性對照組之間TLP活性比較差異有統計學意義，說明當野菊花提取物濃度為0.6250和0.1325g·L－1時，2種狀態的TLP活性均降低，野菊花提取物對TLP活性及蛋白水解作用有明顯的抑制作用；當野菊花提取物濃度為0.1563g·L－1時，對游離狀態與結合態的TLP比活無明顯影響。當野菊花提取物濃度降低時，結合態和游離態TLP活性升高，野菊花提取物濃度越高，對P.g的TLP酶抑制作用越強。

同時，培養物上清液中TLP活性低于菌細胞破碎后上清液，且酶比活也較低，在同一野菊花提取物濃度下，3個野菊花組上清液中游離態TLP比活與結合態TLP比活比較差異有統計學意義，說明野菊花提取物對游離態的TLP的抑制作用強于結合態TLP。

本研究結果表明：對倍稀釋法稀釋野菊花提物取對P.g結合態TLP活性和蛋白水解能力有明顯抑制作用，濃度越大，抑制作用越強；高濃度野菊花提取物對游離態TLP活性及蛋白水解能力有抑制作用，而低濃度野菊花提取物對游離態TLP活性及蛋白水解能力的抑制作用不明顯。

中藥野菊花在我國分布廣泛，原料易得，安全無毒副作用，不會引起長期使用抗生素產生的耐藥性和菌群失調，在口腔牙周病防治方面具有廣闊的應用前景。

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