硒蛋白P基因多態性與結直腸癌遺傳易感性的關聯性分析

張 龍，朱 燕，王曉春，張峻烽，呼如芯，李宇菲，李春波

（中南大學湘雅醫學院醫學檢驗系，湖南 長沙 410013）

硒蛋白P（selenoprotein P，Sepp1）為硒蛋白家族主要的成員，為雙功能蛋白，主要由肝臟合成后分泌到外周血中，進而運輸硒到肝外組織供其利用，用以合成其他硒蛋白；同時Sepp1還具有抗氧化酶的活性，與其他抗氧化酶一起構成機體氧化防御屏障，在保護機體免受氧化損傷、維持結構蛋白和基因組DNA的穩定方面起重要作用。rs7579位于Sepp13′UTR，該位點的基因變異可以影響Sepp1合成過程中硒代半胱氨酸的插入進而影響Sepp1的合成及其在血中的存在形式，進而影響其功能的發揮，而國內外研究［1－5］顯示：Sepp1基因多態性與乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤發生有密切關聯，基于Sepp1基因的功能及其在惡性腫瘤中的異常表達模式，本文作者推測Sepp1基因的遺傳變異與腫瘤易感性有關聯。國內未見相關研究報道，本課題組就Sepp1基因rs7579位點單核苷酸多態性 （SNPs）在結直腸癌患者和健康人群中分布情況進行研究，探討其對結直腸癌的患病風險的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對照研究。結直腸癌組為2013年9月—2014年7月在本院附屬腫瘤醫院住院的結直腸癌患者，共130例，結直腸癌組納入標準：來自湖南省，中國南方漢族人，年齡25～85歲，病理組織學確診為結直腸癌的新發患者，病理類型為腺癌。其中高分化腺癌74例，中分化腺癌46例，低分化腺癌10例；腫瘤位于近側大腸（盲腸、升結腸和橫結腸）39例，位于遠側大腸（降結腸、乙狀結腸及直腸）91例；男性85例，女性45例；平均年齡 （56.2±10.6）歲。排除標準：并發其他胃腸道遺傳病史，有放化療史，受試者有血緣關系。健康組共153名，系中南大學湘雅三醫院同期門診健康體檢者，其中男性85名，女性59名，平均年齡 （50.1±14.0）歲。健康組納入標準：經結腸鏡檢查無結直腸息肉，無潰瘍性結腸炎，無腫瘤史，常規體檢結果均正常。排除標準：受試者有血緣關系，非湖南省漢族人，年齡小于25歲或大于85歲。本研究經受試者知情同意，研究方案經本院倫理委員會審查并認可。

1.2 主要試劑和儀器 血液基因組DNA提取試劑盒 （美國OMEGA生物技術有限責任公司），5×TBE （pH 8.3） （上海生工生物工程有限公司），100bp DNA MarkerⅠ和2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）。DYY－Ⅲ5穩壓溫流電泳儀 （北京六一儀器廠），Eppendorf Mastercycler個人型PCR儀 （德國Eppendorf公司），UV－160分光光度計 （日本島津制作所），Universal HoodⅡ凝膠成像分析系統（美國Bio－Rad公司）。

1.3 基因組DNA提取 清晨抽取空腹靜脈血2mL，EDTA抗凝，采用試劑盒抽提外周血基因組DNA，UV－160分光光度計測定DNA純度和濃度，波長設定為260和280nm，－20℃保存備用。

1.4 引物設計和合成 在Pubmed－SNP數據庫中查詢Sepp1基因rs7579位點兩側的基因序列（Z11793），應用軟件Primer premier 5.0設計引物（表1），特異性內引物F1和R1分別在3′端倒數第3位引入1個人為的錯配堿基 （引物中劃線部分）可增加分型的特異性，F1和R2組合檢測G等位基因，其PCR產物大小為212bp。F2和R1組合檢測A等位基因，其PCR產物大小為183bp，外引物F2和R2組合擴增出長度為338bp的PCR產物，作為陽性對照。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 rs7579位點的引物信息Tab.1 Primer information of rs7579site

1.5 四引物擴增阻礙突變體系聚合酶鏈反應（tetra－primer ARMS－PCR） PCR 反 應 體 系 為25μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，DNA 模板2μL （約 100ng），F2和 R2（10μmol·L－1）各0.4μL，F1和R1（10μmol·L－1）各0.8μL。滅菌雙蒸水8.1μL。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。PCR產物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，在Universal HoodⅡ凝膠成像分析系統中判讀并拍照記錄。隨機選取40個標本進行PCR擴增后將產物送上海生工生物工程有限公司測序，所用引物為表1中的F2和R2，PCR反應體系為50μL，其中2×Taq PCR Master Mix 25μL，DNA模板4μL，F2（10μmol · L－1） 0.8μL， R2（10μmol·L－1）0.8μL，滅菌雙蒸水19.4μL；PCR反應條件同tetra－primer ARMS－PCR的反應條件。

1.6 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。采用χ2檢驗分析研究對象的Sepp1基因rs7579位點的基因型和等位基因分布情況是否符合Hardy－Weinberg平衡，各組研究對象基因型頻數和等位基因頻數分布的差異比較采用χ2檢驗，采用Logistic回歸分析計算基因型與結直腸癌危險性的優勢比 （OR）及其95%可信區間 （95%CI）。

2 結 果

2.1 Sepp1基因rs7579位點多態性 PCR擴增產物中陽性對照片段長度為338bp，G等位基因特異性片段為212bp，A等位基因特異性片段為183bp；即GG基因型PCR擴增產物大小為338和212bp，AA基因型PCR擴增產物大小為338和183bp，GA基因型PCR擴增產物大小為338、212和183bp。見圖1。

2.2 序列法驗證tetra－primer ARMS－PCR結果的準確性 測序結果顯示：Sepp1基因rs7579位點有3種基因型，分別為GG、GA和AA，見圖2，測序結果與tetra－primer ARMS－PCR結果完全一致。

圖1 Sepp1基因rs7579位點tetra－primer ARMS－PCR電泳圖Fig.1 Electrophoregram of tetra－primer ARMS－PCR of polymorphism of rs7579site at Sepp1gene

圖2 Sepp1基因rs7579位點部分測序圖Fig.2 Part of sequencing figure of rs7579site at Sepp1 gene

2.3 2組研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型和等位基因頻數分布 結直腸癌和健康對照組研究對象Sepp1基因rs7579位點多態性分布情況均符合Hardy－Weinberg平衡，所觀察的樣本具有群體代表性 （χ2＝0.028，P＞0.05）。經χ2檢驗及非條件Logistic回歸分析：結直腸癌組患者和健康對照者的Sepp1基因rs7579位點GG、GA和AA基因型和G、A等位基因頻數比較差異無統計學意義 （χ2＝3.633，P ＞0.05；χ2＝2.152，P ＞0.05）。提示Sepp1基因rs7579位點與結直腸癌發病無關聯。見表2。

表2 健康對照組和結直腸癌組研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型及等位基因頻數分布Tab.2 Distribution of genotypic frequency and allelic frequency of rs7579site at Sepp1gene of objects in control group and case group ［n（η／%）］

2.4 不同臨床特征研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型頻數分布 根據臨床資料將2組研究對象進行分層分析，在對年齡進行分組時，≥55歲組中，結直腸癌組和健康對照組研究對象的GG、GA和AA基因型頻數比較差異有統計學意義（χ2＝3.228，P＝0.050），結直腸癌組患者 AA基因型頻數明顯低于健康對照組，即人群中AA基因型者患結直腸癌風險低于GA基因型者 （OR＝0.566，P＝0.050，95%CI：0.320～0.999），而在＜55歲組、男性組、女性組、大腸近側組、大腸遠側組、高分化腺癌組、中分化腺癌組、低分化腺癌組中，結直腸癌組和健康對照組研究對象GG、GA和AA基因型頻數分布比較差異均無統計學意義 （χ2＝1.154，P＝0.684；χ2＝2.787，P＝0.261；χ2＝1.084，P＝0.464；χ2＝4.171，P＝0.083；χ2＝1.766，P＝0.544；χ2＝2.790，P＝0.281；χ2＝0.273，P＝0.747；χ2＝7.629，P＝0.119），提示Sepp1rs7579位點多態性對結直腸癌患病風險的影響與年齡有關聯，但與性別、腫瘤部位和腫瘤分化程度無關聯。見表3。

表3 不同臨床特征研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型頻數分布Tab.3 Distribution of genotypic frequencies of rs7579site at Sepp1gene of objects with different characteristics

3 討 論

Sepp1是硒蛋白家族中非常重要的成員之一，占血漿總含硒量的40%［6］。Sepp1含有2個結構域為雙功能蛋白，由2個大小不同的片段構成，大片段為N端，含有244個氨基酸殘基，僅含的1個Sec（硒代半胱氨酸）殘基位于UxxC氧化還原模體中 （U為硒代半胱氨酸，x為任意氨基酸，C為半胱氨酸），具有抗氧化酶的活性；小片段為C端，含有122個氨基酸殘基，從第245位殘基到C－末端，含有9個硒代半胱氨酸殘基，具有運送硒供外周組織利用的功能［7］。Sepp1由肝臟合成后分泌入血，進入外周組織C端片段分泌硒被組織細胞攝取，N端片段與細胞膜具有較強的親和力，釋放了硒的Sepp1結合到細胞膜上發揮抗氧化的作用［8］；此外，Sepp1是機體硒儲存庫，對維持血漿含硒量穩定等方面具有重要作用［9］。總之，Sepp1在保護機體免受氧化損傷、運輸硒到非肝臟組織、維持機體硒含量穩定等方面具有重要作用［8，10］。

本課題組發現：中國人群中，結直腸癌患者和健康對照者Sepp1基因rs7579位點GG、GA和AA基因型及G、A等位基因頻數比較差異無統計學意義，Sepp1基因rs7579位點多態性與結直腸癌的患病風險無關聯。根據臨床資料將2組研究對象進行分層分析結果顯示：年齡≥55歲組中，結直腸癌組和健康對照組研究對象GG、GA和AA基因型頻數比較差異有統計學意義，結直腸癌組患者AA基因型頻數明顯低于健康對照組，即人群中AA基因型者患結直腸癌風險低于GA基因型者，A等位基因可能是55歲以上中國人群降低結直腸癌發病的保護性因素之一。rs7579位于Sepp13′UTR，該位點的基因變異可以影響Sepp1合成過程中硒代半胱氨酸的插入進而影響Sepp1的合成［11］；人血漿中含有2種形式Sepp1，分別為50000和60000，60000形式Sepp1的硒水平比50000高，可以運輸更多的硒供外周組織利用。而Meplan等［12］研究發現：rs7579多態性位點，AA基因型人群中60000形式Sepp1水平比GG基因型人群中60000形式Sepp1水平高。隨著年齡不斷增長，細胞代謝活性降低，機體運輸硒的能力也會降低，rs7579多態性位點中，因AA基因型Sepp1含硒量高，其也許可以更好地滿足機體對硒的需求，進而降低結直腸癌的患病風險。Sutherland等［13］研究發現：韓國人群中Sepp1基因rs7579位點多態性對結直腸癌的發病風險無影響，而Sutherland等并未對其進行亞層分析，故55歲以上韓國人群中未能確定Sepp1基因rs7579位點多態性對結直腸癌的發病風險產生的影響。

綜上所述，Sepp1基因rs7579位點多態性對結直腸癌的影響在不同人群中具有不同的影響結果，人群研究結果的差異，反映出腫瘤遺傳易感性研究的復雜性。此外，研究結果除了與樣本的數量大小有關系，還與不同地區、種族和研究人群的遺傳背景有關聯，基因間相互作用及與環境危險因素的相互作用對腫瘤的患病風險亦有著較大的影響［14－15］。結直腸癌發生發展的每個步驟中涉及多個基因的改變，表現為多基因、多步驟的協同累積作用，同時突變基因型與環境危險因素之間有較強的交互作用，增加了結直腸癌的患病風險。結合本實驗研究結果和國外研究動態可知：Sepp1基因rs7579位點多態性對結直腸癌遺傳易感性的關聯性尚需在不同種族人群中聯合其他影響因素 （如飲食結構、有無煙酒史及腫瘤家族史等）進一步證實。

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