核輸入蛋白α/β真核表達載體的構建及細胞內定位

羅曉麗 ，周蕾，丁麗華，張亞楠，劉婕，賈曉蒙，陳瀅潔，熊加秀，陳志達，葉棋濃，趙麗純

1.吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021；2.首都醫科大學 附屬北京世紀壇醫院腫瘤內科，北京 100038；3.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850

細胞外信號主要通過相應受體及細胞內信號轉導從而引起細胞發生核反應，在細胞增殖、分化、發育、凋亡及與細胞反應有關的物質合成調控中起重要作用。進入胞質的信號分子及其活化產物必須通過核膜進入細胞核，才可以引起核反應。真核細胞核膜上分布的核孔復合體（nuclear pore complex，NPC）是細胞核內外進行物質交換的主要通道，分子較小的化合物可自由通過NPC或采取被動擴散的方式進入細胞核，而相對分子質量在50 000以上的蛋白則通過主動轉運進入細胞核[1]，而核輸入蛋白（importin）能幫助具有核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的蛋白質入核，在蛋白質的入核過程中發揮十分重要的作用。核輸入蛋白有α和β兩種亞基，存在于胞質中，入核蛋白通過NLS識別細胞質內的核輸入蛋白α，并與之結合形成“核輸入蛋白-底物”二聚體，再與核輸入蛋白β形成復合物，幫助入核蛋白通過NPC 進入核內，在核內RanGTP 酶的作用下，復合物發生解聚，入核蛋白被釋放在核內[2]，而核輸入蛋白與RanGTP 形成新的復合物通過NPC重返細胞質，在胞質內RanGTP 水解為RanGDP，同時核輸入蛋白被釋放參與新一輪的入核轉運[3]。

我們擬構建核輸入蛋白α/β的真核表達載體，并通過免疫熒光染色技術確定其細胞定位，為進一步研究其生物活性及應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T 細胞、pXJ-40-myc 載體來自軍事醫學科學院生物工程研究所；限制性內切酶、DNA連接酶、PCR 試劑購自TaKaRa 公司；VigoFect 購自威格拉斯生物技術有限公司；質粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清購自Gibco公司；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；測序由北京奧科生物技術有限公司完成。

1.2 myc-Importin α/β重組質粒的構建與測序

以乳腺癌文庫為模板，根據文獻報道的核輸入蛋白α/β的編碼序列[4-5]合成引物。核輸入蛋白α上游引物為5'-CGGGATCCATGTCCACCAACGAGAA TGC-3'，下游引物為5'-ATAAGAATGCGGCCGCCT AAAAGTTAAAGGTCCCAGG-3'；核輸入蛋白β上游引物為5'-CGGGATCCATGGAGCTGATCACCATTC TCG-3'，下游引物為5'-ATAAGAATGCGGCCGCTC AAGCTTGGTTCTTCAGTTTC-3'。按以下條件進行PCR 擴增：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，30個循環；72℃7 min再延長。用膠回收試劑盒回收PCR產物。

用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/NotⅠ酶切，形成帶有與載體相同黏性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc 載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，液體培養基振蕩培養并提取質粒，用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送北京奧科生物技術有限公司測序。

1.3 細胞轉染和Western印跡檢測

按常規方法進行轉染。用含雙抗、含100 mL/L胎牛血清的DMEM 培養基將293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，培養24 h 后進行轉染，轉染前1 h 換液。將4 μL Vigo-Fect 與200 μL NaCl 混合，再將總量為10 μg 的重組質粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空pXJ-40-myc 載體作為對照，37℃、5% CO2常規培養，4～6 h換液。質粒轉染293T細胞24 h 后收集細胞蛋白，加入2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDSPAGE 后，電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP 標記的抗myc 標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫熒光檢測

將轉染后培養24 h的24孔板從培養箱中取出，1×PBS 洗3 次；用40 g/L 多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，每次10 min；加入含0.5% Triton X-100和1%羊血清的PBS 冰上滲透10 min；用含1%羊血清的PBS 封閉30 min，滴加Alexa Fluor 594 標記的抗myc-tag 抗體（1∶2000），室溫孵育1 h；1×PBS 洗3次，每次10 min；用0.1 g/mL DAPI染核，1×PBS洗2次，每次5 min；封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 myc-Importin α/β重組質粒的構建與鑒定

以本實驗室保存的乳腺癌文庫為模板，PCR 擴增核輸入蛋白α/β的編碼序列，分別獲得約1590 和2630 bp 的DNA 片段，與預期大小一致（圖1）。將PCR產物用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切后，再與經相同酶切的pXJ-40-myc 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆進行菌液PCR 鑒定，初步篩選帶有核輸入蛋白α/β基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質粒，經酶切鑒定均可切出2 條長度分別約為5000和1590 bp 及5000 和2630 bp 的條帶，符合預期結果（圖2）。DNA序列測定結果表明插入片段的DNA序列與核輸入蛋白α/β基因的編碼序列完全一致（數據略）。

2.2 Western 印跡檢測myc-Importin α/β在293T 細胞中的表達

圖1 PCR擴增核輸入蛋白α/β的編碼序列

將構建的myc-Importin α/β重組質粒和myc 空載體分別轉染293T 細胞系，24 h 后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western 印跡檢測蛋白表達。結果顯示，轉染重組質粒后，用myc-HRP 抗體能夠在相對分子質量約62×103和100×103大小處分別檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶（圖3），說明重組蛋白在293T細胞中能夠正確表達。

2.3 熒光顯微鏡觀察myc-Importin α/β在293T 細胞中的定位

為了了解核輸入蛋白α/β在細胞中的定位，將構建的myc-Importin α/β重組質粒和空載體分別轉染293T細胞系，培養24 h后在顯微鏡下觀察。結果顯示，在轉染myc-Importin α重組質粒的293T細胞中，紅色熒光在細胞質與細胞核中均有分布；而轉染myc-Importin β重組質粒的293T 細胞中，紅色熒光主要集中于細胞核。說明myc-核輸入蛋白α融合蛋白表達后在293T 細胞質與細胞核中均有分布，而myc-核輸入蛋白β融合蛋白主要定位于細胞核（圖4）。

據文獻報道，核輸入蛋白存在于細胞質中，運送蛋白進入細胞核[6]，而在本實驗中通過免疫熒光檢測到核輸入蛋白α存在于細胞質和細胞核，而核輸入蛋白β主要存在于細胞核。我們認為細胞轉運所描述的是一個動態過程，而免疫熒光技術是把蛋白固定在了一個時間點再進行檢測，另外可能由于實驗方法的不同，所以出現了其主要定位于核中的情況。

圖2 重組質粒myc-Importin α/β的BamHⅠ/NotⅠ雙酶切產物電泳圖譜

3 討論

核輸入蛋白α通過識別和結合靶蛋白的NLS 幫助蛋白質入核，是核孔靶向復合物的重要組成部分。其主要分為3 個結構單元：未知功能的親水羧基端、帶正電既能結合自身序列中的串聯重復模體又能結合核輸入蛋白β的結構域（importin β binding doman，IBB），以及一個大的NLS 中央結合結構域[7]。核輸入蛋白α在進化過程中結構和功能上比較保守，如人的6 個輸入蛋白呈現60%的序列相似性[8-9]；而核輸入蛋白β家族成員在功能上保守，在蛋白質序列上呈現較低的相似性[10]。核輸入蛋白β家庭成員相對分子質量為95×103～145×103，結構上都具有保守的N端Ran結合結構域（IBN-N domain）和多個HEAT Repeats結構域[11]。HEAT是由連續重復的37～46 個氨基酸殘基組成的螺旋形棒狀結構單元，而HEAT Repeats是由多個這樣的結構域疊加形成的具有延展性的超螺旋，可以通過改變構象以配合結構不同的底物。另外，核輸入蛋白β可以使用4種接頭蛋白來識別不同類型的底物，從而使得一個受體可以擁有廣泛的底物類型，協調了少數受體與大量底物之間的矛盾[12-13]。大多數核輸入蛋白β家族成員可以直接識別底物的NLS 并與之結合，而核輸入蛋白β1 卻需要通過與核輸入蛋白α的N 端IBB結構域結合[14]，借助其作為接頭蛋白，從而識別具有經典核定位信號的底物。

圖3 Western印跡檢測重組核輸入蛋白在293T細胞中的表達

圖4 myc-Importin α/β在293T細胞中的定位（熒光顯微鏡，×400）

核輸入蛋白家族成員介導真核細胞核質轉運，是核質轉運的重要樞紐，也是外來蛋白質進入宿主細胞的有效途徑，如一些病毒是通過與核輸入蛋白α的結合從而完成入核[15]。Smad-3 具有保守的NLS序列，與Smad-4 結合形成Smad-3/Smad-4 復合物，輸入蛋白可識別其NLS 序列從而運送其入核，通過Smad-3/Smad-4 的MH1 發夾樣結構與DNA 上的Smads結合元件（smads-binding element，SBE）結合，在其他轉錄因子的協同作用下調節靶基因的轉錄，從而實現信號轉導[16]。MDM2 可以與p53 的轉錄活性結構域結合，抑制p53 的轉錄活性[17-18]；MDM2 也可以通過其自身的NES和NLS序列從胞核向胞質轉位，并將p53蛋白移位至胞質中，然后在胞質蛋白酶的作用下p53 蛋白被降解，從而使細胞發生抗凋亡而癌變[19]。

蛋白質入核是十分復雜的生物學過程，受到蛋白質磷酸化水平、核轉運因子等諸多因素在多個水平上的多重調控，從而使得功能蛋白及其他核蛋白精確分布并正常發揮功能。若蛋白質的核質轉運受到干擾，將影響其功能的發揮，最終導致疾病的發生。探明蛋白質的入核機制和調節機制，對研究機體的生命活動，闡明疾病發生、發展機理，以及對新藥物的研發都具有重要意義。

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