人自噬相關基因12真核表達載體的構建及表達

紀貝貝 ，張鵬，徐小潔，梁迎春，黃蓉，范忠義，李玲，郭靖，洪甜，，葉棋濃，杜楠

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫院 第一附屬醫院，北京 100048；3.解放軍302醫院 普外診療中心，北京 100039

人自噬相關基因12（autophagy related gene 12，ATG12）是自噬相關基因家族成員，對自噬的形成至關重要[1]。自噬是細胞維持穩態的一種機制，細胞內多數衰老長半衰期蛋白質可通過自噬途徑降解，從而維持細胞內穩定[2]。研究發現自噬參與腫瘤、病原體免疫的過程，自噬可通過一系列機制將腫瘤細胞[3]、入侵的病原體[4]等降解，其機制為，來自高爾基復合體或粗面內質網的單層或雙層膜將抗原包裹后形成自噬泡，自噬泡的外膜與溶酶體膜融合，內膜及其包裹的物質進入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解，從而維持機體穩定。

ATG12 可以和ATG5、ATG16 結合形成復合物，該復合物參與自噬體的形成[5]，在自噬過程中發揮重要作用[6-7]。ATG3 蛋白是一種泛素樣綴合酶，它和ATG10 是促進ATG8 和ATG12 泛素樣蛋白結合的2種E2 樣酶[8]。有文獻報道稱，在自噬過程中ATG12可與ATG3 相互作用[9]。鑒于ATG12 在自噬中的重要作用，我們擬構建ATG12 的真核表達載體，并驗證表達的myc-ATG12 融合蛋白與ATG3 的相互作用，為進一步研究ATG12與自噬的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞由本室傳代培養；pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；Flag-ATG3 質粒為本實驗室前期構建；VigoFect 為威格拉斯生物技術有限公司產品；限制性內切酶、DNA 連接酶、PCR 試劑均購自TaKaRa 公司；上、下游引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；質粒提取、膠回收、PCR 回收試劑盒購自Promega公司；HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體（myc-HRP）和抗Flag標簽鼠單克隆抗體（Flag-HRP）購自Sigma公司；DMEM及小牛血清購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 myc-ATG12重組質粒的構建與測序

以本實驗室保存的人乳腺文庫為模板，根據文獻報道[10]的ATG12 編碼序列合成上游引物（5'-CG GGATCCATGGCGGAGGAGCCGCAGTCTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCATCCCCACGCCTGAG ACTTGC-3'），PCR 擴增人ATG12 的編碼序列（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產物。

用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/XhoⅠ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA 連接酶連接入pXJ-40-myc載體；轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養并提質粒，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細胞轉染和Western印跡檢測

按常規方法進行轉染，用不含雙抗、含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養基將293T 細胞接種于6 cm 皿中，接種量以轉染時細胞密度達80%為宜，培養24 h 后進行轉染，轉染前1 h 換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空pXJ-40-myc 載體作為對照，37℃、5% CO2常規培養，4～6 h換液。質粒轉染293T細胞24 h 后收集細胞蛋白，加入2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDSPAGE后電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP 標記的抗myc 標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫共沉淀檢測ATG12和ATG3的相互作用

將人胚腎293T 細胞接種于6 cm 皿中，用重組myc-ATG12 與Flag-ATG3 共轉染細胞，轉染后4～6 h 換液，常規培養24 h 后收集細胞，加入中鹽（0.25 mol/L）IP 緩沖液后與myc-beads 于4℃結合4～6 h，3000 r/min 離心5 min，經中鹽IP 緩沖液再次漂洗后，加入與myc-beads 等量的2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE后電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的抗myc和Flag標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，用化學發光法顯色，5 min后壓片顯影。

2 結果

2.1 myc-ATG12重組質粒的構建與鑒定

以實驗室保存的人乳腺文庫為模板，PCR 擴增人ATG12 的編碼序列，獲得約420 bp 的DNA 片段，與預期一致（圖1）。將PCR 產物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后，與經同樣雙酶切的pXJ-40-myc 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆提質粒，經酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和420 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結果（圖2）。測序結果表明，插入片段的DNA 序列與人ATG12基因的編碼序列完全一致（數據略）。

圖1 PCR擴增人ATG12的編碼序列

圖2 重組質粒myc-ATG12的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

2.2 Western 印跡檢測myc-ATG12 在293T 細胞中的表達

將構建的myc-ATG12 重組質粒和空載體分別轉染293T 細胞，24 h 后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western 印跡檢測myc-ATG12 蛋白的表達。結果顯示，轉染重組質粒后，用myc-HRP 抗體能夠在相對分子質量約17×103處檢測到明顯的特異性條帶，而空載體則無條帶（圖3）。說明myc-ATG12重組蛋白在293T細胞中能夠正確表達。

2.3 免疫共沉淀檢測ATG12與ATG3的相互作用

根據文獻報道，ATG12 可與ATG3 蛋白相互作用。為進一步證實構建的myc-ATG12 重組質粒正確，且能夠表達正確的融合蛋白，將重組myc-ATG12 質粒與Flag-ATG3 質粒共轉染293T 細胞，24 h常規培養后收集蛋白，免疫共沉淀分析觀察顯示，myc-ATG12 融合蛋白與Flag-ATG3 蛋白具有相互作用，而myc 空載體在同一位置無此條帶，表明ATG12 與ATG3 蛋白能夠在體內特異地相互作用，而myc 標簽不影響ATG12 的結構及其生物學功能（圖4）。進一步證明構建的重組myc-ATG12質粒正確，且能夠正常表達。

3 討論

自噬是一種普遍而又重要的生命現象，廣泛參與多種生理和病理過程，特別是與腫瘤發生密切相關。目前，自噬的調控作用被廣泛關注并加以研究，以求從分子水平上對腫瘤進行治療，從而達到根治的目的[11-13]。針對ATG的調控是現在自噬研究的熱點。根據其在自噬過程的不同階段發揮作用的不同，可將ATG 分為以下三類：一是ATG1-ATG11-ATG17-ATG20-ATG24-ATG29-ATG31 和ATG13-ATG8 復合體，二是ATG6-ATG14-Vps34-Vps15 復合體，三是ATG12-ATG5-ATG16和LC3-II-PE泛素樣蛋白系統[14]。可見ATG12與自噬體的形成密切相關。有研究顯示ATGl2缺失的小鼠胚胎干細胞前自噬體結構和自噬體的數量明顯減少[15]。

圖3 Western印跡檢測myc-ATG12的表達

圖4 免疫共沉淀分析驗證重組ATG12與ATG3在蛋白水平上具有相互作用

ATG12 定位于細胞質和自噬體中，同時介導自噬和凋亡兩條通路[16]，在自噬過程中和ATG5的結合是不可逆的，同時與ATG3 的結合區域也有很多疑惑待解決[17]。本實驗構建的myc-ATG12在真核細胞中獲得了表達，且表達的融合蛋白能夠與ATG3 蛋白相互作用。ATG12 在真核細胞中的成功表達，是繼續深入研究其在自噬中的作用機制，以及探討其利用價值的基礎。

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