鹿茸多肽對人骨髓間充質干細胞BMP－2和Runx2表達的影響

張洪長，張 瑩，劉明昕，潘 志，律廣富，陳 港，姜鴻遠，郭駿騏

（1.長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心藥理研究室，吉林 長春 130117；2.吉林大學藥學院藥理學教研室，吉林 長春 130021；3.長春中醫藥大學圖書館參考咨詢部，吉林 長春 130117；4.長春中醫藥大學科技處，吉林 長春 130117）

鹿茸多肽（velvet antler polypeptides，VAP）是從梅花鹿茸中提取的一種多肽類生物活性因子，具有促進骨及軟骨愈合［1］、促神經再生功能［2］、加速皮膚創面的愈合［3］和提高人體的免疫能力［4－5］等功能。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內的多功能干細胞，一定條件下可向成骨細胞方向轉化。骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein－2，BMP－2）是一種多功能蛋白，可以誘導新骨形成和骨折愈合［6］，在胚胎發育過程中調節干細胞增殖分化方面有著重要的作用，且在體外能夠誘導干細胞成骨和成軟骨分化［7－8］；BMP－2主要通過經典的Smads信號通路調節成骨分化關鍵轉錄調控因子骨特異性轉錄因子2（runt－related transcription factor 2，Runx2）等的表達，進而轉導成成骨信號，最終促進干細胞的分化。有關VAP通過對Smads信號轉導通路的影響從而促進人BMSCs（hBMSCs）中BMP－2和Runx2表達的研究目前少有報道。本研究觀察VAP對hBMSCs中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、增殖分化及BMP－2和Runx2基因、蛋白表達的影響，探討其在BMP2／Runx2信號通路中對hBMSCs增殖和成骨分化的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 hBMSCs來自本課題組志愿者骨髓液（符合倫理要求實驗用標本）；梅花鹿VAP由長春中醫藥大學化學研究室提供；胎牛血清購自美國Thermo公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；ALP、CCK－8細胞增殖－毒性檢測試劑盒、RNA－OUT總RNA提取試劑盒、總蛋白定量測試盒（BCA法）和RIPA細胞裂解液均購自南京建成生物工程研究所，Anti－Runx2、Anti－human BMP－2、辣根過氧化物酶 HRP標記的羊抗鼠二抗均購自美國R＆D Systems公司，Runx2、BMP－2和β－actin蛋白均購自英國Abcam公司。CO2培養箱（新加坡ESCO公司），550型酶標儀（美國Bio－Rad公司），ABI7500PCR擴增儀（德國Biometra公司），垂直板電泳裝置（美國BIO－RAD公司，Mini－ProteinⅢ），DYY40B型轉印電泳槽（北京六一儀器廠），Chemi Imager 5500凝膠電泳成像分析系統（美國 Alphainno－tech Chemi Imager公司）。

1.2 hBMSCs的分離培養 本課題組志愿者簽署知情同意書后，在髂后上棘穿刺采集志愿者的骨髓液5mL，將骨髓液肝素抗凝后，加等量PBS混勻，使之成為單細胞懸液，2500r·min－1離心15min。吸出試管中間骨髓單個核細胞層，加入PBS 3mL，1000r·min－1離心5min，共洗2次。棄PBS，加入培養液混勻，移至塑料細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養48h后棄除懸浮細胞半量換液，之后每2d換液1次，利用hBMSCs可黏附于塑料培養瓶壁生長這一特性進行分離純化［9］。細胞傳代2次后基本除去非貼壁的球形骨髓造血干細胞，得到純化的hBMSCs，選取生長良好的第3代細胞進行實驗。

1.3 細胞分組和給藥 將處于對數生長期的hBMSCs接種于含有10% 胎牛血清DMEM培養基的培養皿中，37℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養。細胞分為對照組和給藥組。對照組：連續用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養；給藥組：含10%胎牛血清的DMEM培養液加終濃度為5、10、15和20g·L－1VAP培養。

1.4 ALP活性檢測 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于96孔板，24h待其鋪滿孔底后更換為VAP培養液，給藥組分別加入終濃度為5、10、15和20g·L－1VAP，每3d換VAP培養液1次，誘導培養3、6、9和12d后棄培養液，采用ALP試劑盒測定細胞的ALP活性，酶聯免疫檢測儀測定420nm處吸光度（A）值，以A值表示ALP活性，將ALP活性最高時的VAP濃度確定為其最佳濃度，作為后續實驗中VAP的濃度。

1.5 CCK－8法檢測hBMSCs增殖率 選擇生長良好的第3代hBMSCs，以5×104mL－1的密度接種于96孔板中，每孔100μL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組各5孔，共60孔，置于5%CO2、37℃培養箱中，24h貼壁后每隔3d各取5孔測定細胞增殖情況。檢測時吸出培養液，每孔加入不含胎牛血清的DMEM培養液100μL及CCK－810μL，CO2培養箱中孵育2h，用酶聯免疫檢測儀測定450nm處的A值，計算細胞增殖率。細胞增殖率＝（實驗組A值－對照組A值）／對照組A值×100%。

1.6 熒光定量PCR法檢測hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達水平 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于6孔板中，每孔2mL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組誘導培養9d后回收，用RNA－OUT提取總RNA，逆轉錄，熒光定量PCR方法測定BMP－2和Runx2mRNA的表達水平，以β－actin為內參。BMP－2上游引物：5′－AGCCCTTCACTGCCATCCTGTC－3′，下游引物：5′－ATTCTCTCGTTCACCGCCCAC－3′，擴增產物長度為 89bp；Runx2 上游引物：5′－CAAAGGTGCAGCCTTTGTGTC－3′，下游引物：5′－TCACAGTCCGGATTGAGCTCA－3′，擴增產物長度為105bp；β－actin上游引物：5′－GGCAACACAGCTCACAAGAA－3′，下游引物：5′－CGCTGTTTTCACAGAGGTCA－3′，擴增產物長度為117bp。PCR反應條件：95℃、60s；95℃、15s；60℃、15s；72℃、45s；共36個循環。通過Oligo 6.0引物設計軟件設計引物序列，由北京奧科生物技術有限公司合成。由計算機自動計算得出CT 值，根據所得CT值應用2－△△CT法計算BMP－2和Runx2mRNA表達水平。

1.7 Western blotting法檢測hBMSCs中 BMP－2和Runx2蛋白表達水平 hBMSCs以5×104mL－1的密度接種于6孔板中，每孔2mL，對照組及終濃度為10g·L－1VAP組誘導培養9d后回收，PBS漂洗2次，加入細胞裂解液RIPA，冰上靜置15min后收集裂解液，將裂解產物反復凍融裂解3次，12000r·min－1離心30min，按照 BCA－200蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，取20μg蛋白經SDS－PAGE凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜5% 脫脂牛奶封閉2h后，孵育一抗（1∶500）4℃ 過夜。0.1%TBST洗滌3次，每次5min；加 入 用 0.1%TBST稀釋的二抗（1∶1000稀釋），室溫孵育1h。0.1%TBST洗5次，每次5min。以ECL化學發光法檢測蛋白印跡，并進行曝光、顯影和定影。數碼相機拍照，Image J2X軟件進行分析，以特定蛋白與β－actin蛋白的灰度值比值表示蛋白表達水平。蛋白表達水平 ＝ 特定蛋白灰度值／β－actin蛋白灰度值。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。各組hBMSCs中ALP活性、細胞增殖率、BMP－2及Runx2基因和蛋白表達水平以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組hBMSCs中ALP活性 ALP活性檢測結果顯示：5、10、15和20g·L－1VAP組hBMSCs誘導培養3、6、9和12d后，ALP活性均高于對照組（P＜0.01），10g·L－1VAP組細胞中ALP活性為最高，故后續實驗皆采用此濃度。見表1。

2.2 VAP作用不同時間后hBMSCs增殖率CCK－8法檢測結果顯示 ：與對照組比較，10g·L－1VAP組hBMSCs生長速度明顯加快，貼壁后VAP誘導3d即出現了生長速度的差異，此后出現明顯的生長速度差異，到第9天時，對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs的增殖均達到高峰，且進入平臺期。見表2。

2.3 熒光定量PCR檢測hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達水平 hBMSCs誘導培養9d后，10g·L－1VAP組hBMSCs中 BMP－2和Runx2mRNA表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表1 各組hBMSCs中ALP活性Tab.1 ALP activities in hBMSCs in various groups （n＝6，）

表1 各組hBMSCs中ALP活性Tab.1 ALP activities in hBMSCs in various groups （n＝6，）

＊P＜0.01 vs control group.

y 0 3 6 9 12 Control 2.6±0.3 4.8±0.1 6.3±0.2 9.3±0.1 8.1±Group ALP activit（t／d）0.1 VAP（g·L－1）5 2.4±0.1＊ 6.7±0.2＊ 9.7±0.1＊ 14.2±0.2＊ 11.3±0.0＊10 2.8±0.1＊ 8.7±0.1＊ 12.8±0.2＊ 17.2±0.2＊ 14.2±0.1＊15 3.0±0.1＊ 6.4±0.1＊ 9.4±0.1＊ 13.2±0.0＊ 11.7±0.1＊20 2.7±0.1＊ 5.8±0.0＊ 8.7±0.2＊ 13.1±0.1＊ 10.8±0.1＊

表2 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs增殖率Tab.2 Proliferation rates of hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，，η／%）

表2 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs增殖率Tab.2 Proliferation rates of hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group.

0 3 6 9 12 Control 0 47.9±0.0 103.4±0.0 157.4±0.0 112.2 Group Proliferation rate（t／d）±0.0 VAP（10g·L－1）0 85.5±0.0＊ 170.8±0.0＊ 276.2±1.0＊ 178.9±0.0＊

表3 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達水平Tab.3 Expression levels of BMP－2and Runx2mRNA in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（）

表3 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2mRNA表達水平Tab.3 Expression levels of BMP－2and Runx2mRNA in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（）

＊P＜0.05 vs control group.

Group BMP－2 Runx2 Control 2.62±0.12 2.55±0.11 VAP（10g·L－1）4.75±0.15＊ 4.67±0.14＊

2.4 Western blotting法檢測hBMSCs中 BMP－2和Runx2蛋白表達水平 hBMSCs誘導培養9d后，Western blotting檢測結果顯示：10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。見表4和圖1。

表4 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，）

表4 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group（n＝6，）

＊P＜0.05 vs control group.

Group BMP－2／β－actin Runx2／β－actin Control 0.482±0.012 0.518±0.011 VAP（10g·L－1）0.725±0.010＊ 0.851±0.012＊

圖1 對照組和10g·L－1VAP組hBMSCs中BMP－2和Runx2蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of BMP－2and Runx2protein in hBMSCs in control group and 10g·L－1VAP group

3 討 論

VAP是從梅花鹿茸中提取的一種多肽類生物活性因子，具有促進骨及軟骨愈合、促神經再生功能、加速皮膚創面的愈合和提高人體的免疫能力等藥理作用，是鹿茸中最有效的成分之一。VAP可使BMSCs的增殖速度加快、ALP活性增加及成骨分化明顯［10］，但其中確切信號傳導通路機制還不完全清楚。BMSCs是骨髓內的多功能干細胞，一定條件下可向成骨細胞方向轉化。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）作為骨生長的啟動因子，可通過調控細胞核內成骨標志基因的表達而誘導未分化間充質細胞不可逆地分化為骨系細胞［11－13］，其中BMP－2是活性最強且能單獨誘導成骨的因子［14－16］，BMP－2通過激活 Smads信號傳導和調節成骨基因轉錄而發揮其成骨作用。對成骨性能的觀察，可以通過檢測ALP活性等來進行判定［17］，ALP在骨化過程中發揮重要的作用。在BMSCs中檢測ALP的活性變化，有助于研究BMP－2因素對BMSCs向成骨細胞方向分化的影響。在成骨分化過程中，BMSCs能夠表達一系列的成骨相關基因產物，如Ⅰ型膠原、ALP、骨橋蛋白和骨鈣蛋白等，Runx2就是調節這些產物生成的重要基因之一。Runx2是成骨細胞特異性的轉化因子［18］，在BMSCs分化為成骨細胞的過程中發揮主導作用［19］。促進BMSCs的成骨分化過程并調節成骨細胞的成熟是Runx2基因的主要功能。BMP－2是調控Runx2基因表達較為有效的上游細胞因子之一，其可通過多種Smads基因通路誘導Runx2表達，并可能通過調節Runx2等其他轉錄因子來影響干細胞的成骨分化［20－22］。本研究通過觀察VAP對hBMSCs中BMP－2和Runx2基因、蛋白表達的影響，闡明在BMP2／Runx2信號通路中VAP對hBMSCs增殖和成骨分化作用的可能分子機制。

綜上所述，VAP能夠提高hBMSCs中ALP活性，促進hBMSCs增殖分化，上調hBMSCs中BMP－2及其下游Runx2基因和蛋白的表達，這可能是VAP對hBMSCs骨形成及骨代謝影響的分子調控機制之一。

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