不同理化因素對重組人成纖維細(xì)胞生長因子21蛋白純度的影響

王長文，劉 敏，劉 磊，姜 勇，張 磊，李 艷，王會巖

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院生物技術(shù)教研室，吉林 吉林 132013）

成纖維細(xì)胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）是最新被發(fā)現(xiàn)的一個成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，屬于成纖維細(xì)胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19） 亞族［1－3］。FGF21作為FGF家族的新成員，其具有調(diào)控多種內(nèi)分泌功能［4］。研究［5－6］顯示：FGF21的功能主要表現(xiàn)在糖脂代謝的調(diào)節(jié)上，其可以不依賴于胰島素而使血糖降低，同時可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，緩解脂肪肝動脈粥樣硬化。近年來在國際上FGF21已成為糖尿病、脂肪肝、肥胖癥和代謝綜合征等代謝疾病研究的熱點藥物，未來有可能替代胰島素成為治療糖尿病的新藥［7－8］。最新研究［9］表明：FGF21能夠保護心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激帶來的損傷。美國Lilly公司已開展FGF21的Ⅱ期臨床觀察［10］。但對重組人FGF21（rhFGF21）的穩(wěn)定性研究目前未見報道。本實驗利用已構(gòu)建的高表達FGF21蛋白基因工程菌株，經(jīng)發(fā)酵純化后，獲得純度大于95%的蛋白［11－12］，對其穩(wěn)定性做進一步觀察和測定，以便為制定rhFGF21的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，也可為其他蛋白質(zhì)類藥物的開發(fā)和生產(chǎn)提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 三氟乙酸和乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；rhFGF21原液由吉林醫(yī)藥學(xué)院王會巖博士提供，純度＞99%。高效液相色譜儀（E2695，紫外檢測器，美國 Waters公司）。

1.2 不同溫度時rhFGF21純度檢測 將一定數(shù)量的樣品放置于25℃、4℃和－20℃下保存，對4℃和25℃樣品每周取樣品若干支進行外觀形狀觀察和HPLC法檢測rhFGF21純度，－20℃樣品保存12個月，每6個月取樣品3支進行檢測，同時觀察外觀性狀。

1.3 不同緩沖體系和pH值時rhFGF21純度檢測緩沖體系終濃度為20mmol·L－1，蛋白水平為0.5g·L－1，醋酸－醋酸鈉緩沖液pH 4.0和pH 5.0、檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris－HCl緩沖液pH 7.5和pH 8.0，分別于每7d取3支樣品觀察rhFGF21原液的外觀性狀變化并對其純度進行測定。

1.4 反復(fù)凍融處理后rhFGF21純度檢測 將一定數(shù)量rhFGF21原液于－20°C凍存，每日固定時間將其融化，然后置于－20°C凍存，如此重復(fù)持續(xù)12d，每3d觀察rhFGF21原液外觀性狀的變化并對其純度進行測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。rhFGF21純度檢測結(jié)果以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：A 相為0.1%三氟乙酸－注射用水；B相 為A甲醇，C和D相均為水；流速0.5mL·min－1；檢測波長280nm；平衡用100%A泵液體至基線穩(wěn)定，洗脫采用不同濃度梯度A泵逐級洗脫，進樣量 10μL。rhFGF21原液HPLC色譜圖見圖1。

2.2 不同溫度時rhFGF21的純度 25℃時，存放14d時rhFGF21純度（15.20%±0.14%）較0d時（100.00%±0.00%）下降，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4℃ 時，存放35d時rhFGF21純度下降至（89.30±0.39）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。－20℃時，存放6個月時rhFGF21純度下降至（99.10±0.39）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；存放12個月時rhFGF21純度下降至（95.30±0.39）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 rhFGF21原液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of rhFGF21original fluid

2.3 不同緩沖體系和pH值時rhFGF21純度25℃條件下rhFGF21在不同pH值的緩沖體系中保存7d后，pH 4.0和pH 5.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液出現(xiàn)渾濁，rhFGF21純度分別下降至（30.60±0.12）%和（45.60± 0.30）%；pH 5.0和pH 6.0檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液出現(xiàn)渾濁，純度降至（55.90±0.90）%和（65.90±0.82）%；pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，pH 6.0緩沖液渾濁，純度為（71.10±0.65）%，pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液澄清透明，純度為（75.10±0.45）%和（80.50± 0.02）% ；pH 7.5和pH 8.0Tris－HCl緩沖液中，pH 7.5緩沖液澄清透明，純度為（81.50±0.22）%和（78.40±0.37）%。以上不同pH 值的緩沖液保存后，與對照組（100.00%±0.00%）比較，rhFGF21純度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 反復(fù)凍融后rhFGF21的純度 rhFGF21原液反復(fù)凍融后，肉眼觀察的結(jié)果和純度檢測一樣，0～3d瓶內(nèi)液體仍澄清，無不溶物出現(xiàn)，反復(fù)凍融3d后，rhFGF21純度 ［（90.80±0.01）%］與對照組［0d，（100.00±0.00）%］比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；6～12d時，發(fā)現(xiàn)肉眼可見的不溶物；反復(fù)凍融6、9和12d后rhFGF21純度分別為（90.80±0.01）%、（82.5±0.02）%和（70.6±0.02）%，與對照組（0d）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，在臨床治療上蛋白質(zhì)藥物已得到大量應(yīng)用，然而由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不好，易失去活性，限制了部分蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用。眾所周知，蛋白質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定性較差，這是由于蛋白質(zhì)在水溶液中容易發(fā)生物理或化學(xué)方面的某些變化。某些物理因素如溫度、離子強度、渦流、表面吸附和化學(xué)降解及修飾作用等均會增加疏水表面積從而影響蛋白質(zhì)的聚合行為，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性降低甚至消失、溶解性的降低和免疫原性的改變［13］。最新研究［14－15］表明：聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾、pH值敏感型聚合物水凝膠等均可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

雖然溫度是影響蛋白質(zhì)和多肽穩(wěn)定性最重要的因素，但其影響機理尚未明確。通常認(rèn)為：溫度越高，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越差。本研究中rhFGF21在水溶液中隨著溫度的升高穩(wěn)定性下降，可能是由于高溫使其化學(xué)降解過程加速。由于蛋白質(zhì)在胞內(nèi)處于中性環(huán)境中，非常穩(wěn)定。但當(dāng)純化后在水溶液中穩(wěn)定性較差。本研究結(jié)果顯示：rhFGF21的穩(wěn)定性在pH 6.5～8.0溶液中優(yōu)于酸性或堿性溶液，而且表現(xiàn)出酸性越強其穩(wěn)定性越差的趨勢，極端的pH值會降低鹽橋的形成能力，從而導(dǎo)致其穩(wěn)定性上的降低。

一些蛋白質(zhì)對溶液的反復(fù)凍融很敏感［16］。本研究中rhFGF21對凍融非常敏感，在以后的生產(chǎn)中要盡量避免反復(fù)凍融。

綜上所述，rhFGF21于低溫和pH 6.5～8.0接近中性條件下呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。而高溫、偏酸性和偏堿性條件對rhFGF21的穩(wěn)定性不利。磷酸鹽緩沖液對rhFGF21穩(wěn)定性呈現(xiàn)出較好的作用。反復(fù)凍融處理對rhFGF21穩(wěn)定性具有明顯的影響。本實驗結(jié)果將為rhFGF21純化工藝的研究、rhFGF21質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和蛋白質(zhì)藥物制劑開發(fā)提供依據(jù)。

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