貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中血管緊張素Ⅱ表達水平的影響

吳忠練，黃學寬，駱 言，張超男，蔣 娟

（重慶醫科大學中醫藥學院中醫經典教學研究室，重慶 401331）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率和死亡率呈增長趨勢，這嚴重影響了患者的生活質量和勞動力，目前缺乏有效的治療方法［1］。關于COPD的發生，公認的有3個發病機制：①氣道和肺部炎癥；②蛋白酶－抗蛋白酶失衡；③氧化－抗氧化失衡。COPD患者大多存在不同程度的肺實質細胞破壞和炎癥細胞浸潤，導致氣道和肺部血管結構的重構。氣道重構是指氣道壁增厚變形，其中平滑肌增厚顯著，導致氣道管腔狹窄和氣流阻力增加的過程。病程進展導致缺氧和二氧化碳潴留，發展為肺動脈高壓和肺心病。

國內外研究［2－3］表明：血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）不僅可誘發強烈氣道平滑肌的收縮，還能通過促進細胞分泌單核細胞趨化蛋白和細胞間黏附分子，引起劇烈的炎癥反應，其是參與慢性氣道炎癥形成和重塑的主要炎性介質之一。COPD患者長期慢性缺氧，肺血管內皮細胞損傷，代償刺激血管平滑肌合成血管緊張素轉化酶，進而催化血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）轉化成AngⅡ［2－4］。AngⅡ有強烈的縮血管作用，隨著血管阻力進一步增加，COPD患者原本的氣道狹窄加重，形成惡性循環。研究［5－6］提示：AngⅡ的表達可以通過縮血管作用，導致氣道重構從而引起肺纖維化。臨床采用中藥方劑貝母瓜蔞散治療COPD［7］很常見，但其機制并不清楚。研究［8－9］表明：浙貝母堿在低濃度下對支氣管平滑肌有明顯擴張作用，并能鎮靜和抗炎。瓜蔞有擴張微血管等作用［8－9］。本研究觀察貝母瓜蔞散對COPD大鼠肺組織中AngⅡ表達的影響，初步探討貝母瓜蔞散對肺組織的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只清潔級雄性SD大鼠（85～110d齡），體質量（200±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK渝20020001。

1.2 藥品和試劑 貝母瓜蔞散由川貝母、瓜蔞、花粉、茯苓、橘紅、白術和甘草等中藥組成，原藥購自重慶西部醫藥商城，經重慶醫科大學中醫藥學院鑒定，按常規方法自制煎劑（即冷水浸30min，煮沸后煎30min，共煎3次，合并藥液，濃縮為1.0g生藥·mL－1），脂多糖（LPS）（美國Sigma公司，批號：20120501），宏聲牌香煙（川渝中煙，焦油量11mg／支，煙氣一氧化碳量12mg／支，煙氣煙堿量10mg／支），AngⅡ抗體（武漢博士德生物有限公司，批號：Y－B2－07D27C）等。

1.3 儀器 切片機（LEZCARM2135），電熱恒溫水溫箱（WSZ－261－79HW1，上海醫用恒溫設備廠），BMJ－Ⅲ型包埋機和Dy89－1型電子玻璃勻漿機（寧波新芝科器研究所），Biofuge fresco低溫離心機（德國Herraces公司），BH－2型光學顯微鏡，顯微攝像儀（日本 Olympus公司），Image－Pro Plus多功能真彩色細胞圖象分析管理系統（美國Media Cybernetics公司），GDS8000凝膠成像分析系統（英國UVP公司），體描箱（北京貝蘭博公司）。

1.4 動物分組和模型建立 30只大鼠隨機分成正常組、模型組和貝母瓜蔞散組，每組10只。動物造模：取SD大鼠適應性飼養1周后，除正常組外，參照宋一平等［10］的方法，將大鼠分別于第1和15天氣道內注入生理鹽水溶解的LPS（200g·100L－1）；第2～14天、第16～31天將大鼠置于密閉玻璃染毒箱中，將香煙插在50mL注射器針頭上點燃后連續抽吸將煙霧注入箱內達到約5%濃度（每次約打入3600mL煙霧），使大鼠被動吸煙，持續30min后將大鼠移出箱子，每天2次，間隔4h以上。其余時間正常喂養。實驗方法：造模期間，注意觀察造模大鼠的精神狀態、活動情況；造模成功后，自第8天起，正常組、模型組大鼠給予生理鹽水灌胃（20mL·kg－1），貝母瓜蔞散組大鼠給予自制貝母瓜蔞散灌胃（20mL·kg－1），每天1次，連續22d。

1.5 肺功能測定實驗 結束后的第31天，用10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）對大鼠進行腹腔內注射麻醉后，行氣管切開置人氣管導管，將大鼠放入體描箱內，外接小動物肺功能檢測分析系統（北京航天新概念軟件公司），記錄大鼠8個自主呼吸周期，獲得氣道壓力（P），容積變化（V），相應計算得到呼吸相氣道阻力（Re）、吸氣相氣道阻力（Ri）；快速向大鼠氣道內注入6mL空氣造成大鼠被動深呼吸，即刻測定用力肺活量（FVC）、0.3s呼氣容積（FEV 0.3）及0.3s用力呼氣容積／用力肺活量（FEV 0.3／FVC）等指標。

1.6 實驗標本獲取和處理 末次實驗后24h，用10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）麻醉放血處死大鼠，將氣管與雙肺暴露，取右下肺，放入4%多聚甲醛中固定。石蠟包埋，切片5μm。AngⅡ免疫組織化學染色步驟按照SP試劑盒操作。各大鼠的免疫組織化學標本隨機選10個視野，光鏡下400倍觀察。多功能彩色圖像分析系統對AngⅡ的蛋白表達進行分析。胞漿棕褐色表示陽性反應，陽性細胞面積反映表達強度。

另將解剖取出的大鼠肺組織用生理鹽水洗凈其表面殘血，濾紙吸干后，精密稱取肺組織0.1g，研磨后加入預冷的蛋白裂解液0.5mL充分裂解。4℃、3000r·min－1離心10min后取上清液。測定蛋白質水平，取100μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸3min后進行12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉PVDF膜，TTBS封閉液37℃封閉2h，滴加兔抗鼠AngⅡ單克隆抗體，4℃過夜，加入1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37℃、2h，DAB顯色。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣方法與β－actin抗體（1∶300）孵育。以β－actin蛋白條帶作為內參，用圖像分析儀測定灰度值，計算目的蛋白相對表達水平。蛋白相對表達水平＝目的蛋白條帶灰度值／內參β－actin條帶灰度值。

1.7 統計學分析 采用SPSS 18.0統計分析軟件進行統計學處理。各組大鼠Re、FEV0.3、FEV0.3／FVC和AngⅡ表達水平以表示，各組之間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 實驗過程中，與正常組比較，模型組和貝母瓜蔞散組大鼠表現出氣急、喘咳、精神萎靡和吐痰流涎、毛發牙齒發黃等特征。而煙熏過程中尤為明顯，有的甚至出現呼吸困難，抬頭張口呼吸。解剖大鼠發現：模型組和貝母瓜蔞組大鼠肺組織顏色灰白晦暗，呈膨脹狀態，模型組尤為明顯，正常大鼠肺組織顏色偏白。見圖1（插頁五）。

2.2 各組大鼠肺功能 與正常組比較，模型組大鼠Re明顯增加，FEV0.3和FEV0.3／FVC明顯降低；與模型組比較，貝母瓜蔞散組大鼠Re明顯降低，FEV0.3和FEV0.3／FVC明顯升高。見表1。

表1 各組大鼠肺 Re、FEV0.3和FEV0.3／FVCTab.1 Re，FEV0.3，and FEV0.3／FVC of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠肺 Re、FEV0.3和FEV0.3／FVCTab.1 Re，FEV0.3，and FEV0.3／FVC of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Re（cmH2O·mL－1·s－1）FEV0.3（V／mL）FEV0.3／FVC（η／%）Control 3.46±0.31 7.02±0.51 87.16±4.40 Model 3.85±0.46＊ 6.48±0.51＊80.46±7.85＊BeiMuGuaLou powder 3.40±0.34△ 6.99±0.63△85.79±3.87△

2.3 各組大鼠肺組織中AngⅡ的表達水平 與正常組比較，模型組和和貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ表達水平明顯增加，積分吸光度（IA）和陽性面積明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ表達水平明顯降低，其主要表達在吸收上皮細胞的細胞膜、細胞漿和細胞核，著色均呈均勻的褐色，陽性面積明顯降低（P＜0.05），IA值明顯降低（P＜0.05）。見表2和圖2（插頁六）。

表2 各組大鼠肺組織中AngⅡ表達水平Tab.2 Expression levels of AngⅡin lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

表2 各組大鼠肺組織中AngⅡ表達水平Tab.2 Expression levels of AngⅡin lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group IA Positive area（S／μm2Control 96.96±16.98 55.72±14.68 Model 141.69±23.77＊ 88.34±9.53＊BeiMuGuaLou powder 119.71±27.29△ 72.56±19.57）△

2.4 各組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達水平 模型組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達水平（0.60±0.09）明顯高于正常組（0.45±0.17）（P＜0.05），貝母瓜蔞散組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達水平（0.48±0.12）明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖3。

3 討 論

目前研究［11－13］認為符合臨床實際的理想COPD動物模型應具備的標準是：①致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致；②必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增加、肺動態順應性下降；③氣道重塑（建）；④可伴有氣道高反應性。根據以上理想COPD動物模型，目前經典造模方法可用熏香煙加氣管內注入LPS法建立COPD大鼠模型，造模完成后，模型大鼠出現明顯喘息、臥底弓背等形態學表現，呼吸功能檢測及氣道炎癥反應證明造模成功。

圖3 各組大鼠肺組織中AngⅡ蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of AngⅡprotein in lung tissue of rats in various groups

COPD是進行性氣流受限為特征的慢性病，涉及肺臟吸入有害氣體和顆粒的異常反應。本實驗設計通過單純被動吸煙法制備COPD大鼠模型，病理形態學檢查符合典型COPD表現，模型復制成功。目前有關COPD和AngⅡ與肺動脈高壓的研究［14］較多，本實驗中模型大鼠長期慢性缺氧，肺血管內皮細胞損傷，代償刺激血管平滑肌合成血管緊張素轉化酶，進而催化AngⅠ轉化成AngⅡ［15］。AngⅡ有強烈的縮血管作用［16］，隨著血管阻力進一步增加，COPD患者氣道狹窄加重，影響呼吸功能，形成惡性循環［17］，而目前尚無有效治療方法［18－21］。本實驗旨在研究貝母瓜蔞散是否可以通過抑制AngⅡ的表達而抑制血管收縮，從而減輕肺部炎癥反應。

《靈樞脹論》：“肺脹者，虛滿而喘咳”，根據COPD患者臨床表現，即咳喘、咯痰和胸悶氣促等癥狀，歸類于中醫 “喘證”、“咳嗽”、“肺脹”等。肺脹多因肺臟受內外邪侵襲，日久則肺虛清肅無權，痰濁潴留，肺不斂降，氣還肺間，肺氣脹滿，復感外邪誘使病情發作或加劇。病久及心，出現喘脫等危候［22］。COPD的病機屬于本虛合并標實［23］。貝母瓜蔞散潤肺清熱，理氣化痰，臨床上常用于治療慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病［24］。貝母瓜蔞散中貝母苦寒，潤肺清熱，化痰止咳；瓜蔞甘寒微苦，清肺潤燥，開結滌痰，與貝母相須為用，是為潤肺清熱化痰的常用組合，共為君藥。花粉清熱滌痰而潤燥為臣；茯苓、橘紅健脾理氣以祛痰為佐；桔梗載諸藥入肺，宣肺利氣為使。共奏清熱潤燥，理氣化痰之功，使肺陰得潤而燥痰可除，清肅有權則咳逆可止。現代運用于肺炎、肺結核等疾病［25］。因此觀察貝母瓜蔞散對肺組織中AngⅡ表達的影響，可反映貝母瓜蔞散對肺組織炎性反應的影響。

本實驗結果顯示：對模型大鼠予以貝母瓜蔞散灌胃，大鼠咳喘、氣急等表現明顯好轉。并測得大鼠AngⅡ的表達在貝母瓜蔞散組中明顯低于未受到干預的模型組。因此推測，貝母瓜蔞散有通過擴張支氣管平滑肌、擴張微血管的作用，而其機制可能與降低AngⅡ的表達有關聯。本實驗證明貝母瓜蔞散對肺功能有改善作用，為臨床上用藥提供了理論指導和依據。

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