正清風痛寧對偏頭痛模型大鼠無菌性神經源性炎癥反應的抑制作用

羅國標，楊 麗，劉曉麗

（1.遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州遵義 563099；2.貴州省黔東南州人民醫院神經內科，貴州 凱里 556000；3.遵義醫學院附屬醫院病理科，貴州 遵義 563099）

偏頭痛是一種慢性反復發作性頭痛，其發病機制尚未完全明了。最近幾年的研究［1－2］表明：炎性細胞因子與偏頭痛的疼痛有關聯；三叉神經系統、神經肽和炎性介質在偏頭痛的病理生理學中起關鍵作用。偏頭痛的經典治療藥物曲馬普坦類藥物具有減少神經肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛血管炎癥反應等藥理作用。正清風痛寧主要成分為鹽酸青藤堿，其具有明顯抗炎、抗免疫、鎮痛、鎮靜和鎮咳等藥理作用，目前已廣泛用于治療類風濕性關節炎等。目前尚未見正清風痛寧用于治療偏頭痛的文獻報道。本實驗觀察正清風痛寧對偏頭痛模型大鼠腦干炎性細胞因子腫瘤壞子因子α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和白細胞介素1β（interleukin－1β，IL－1β）表達及大鼠腦干蛛網膜下腔炎性細胞數的影響，以舒馬普坦為陽性對照，了解正清風痛寧能否減少蛛網膜下腔炎性細胞數及腦干細胞因子（TNF－α和IL－1β）的表達從而抑制偏頭痛的無菌性神經源性炎癥（aseptic neurogenic inflammation，ANI）反應，為正清風痛寧臨床用于治療偏頭痛提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 清潔級 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量（260±60）g，購于重慶第三軍醫大學大坪醫院醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2007－0005。硝酸甘油注射液（nitroglycerin，NTG）（5g·L－1，批號：20100531）購自北京益民藥業有限公司，正清風痛寧緩釋片（每片含鹽酸青藤堿60mg，批號：0903127）購自湖南正清制藥集團股份有限公司，琥珀酸舒馬普坦片（批號：0D6909T）購自天津華津制藥有限公司，兔抗大鼠TNF－α抗體和兔抗大鼠IL－1β抗體購自武漢博士德生物公司。麥克奧迪BA400顯微鏡（麥克奧迪實業）。

1.2 實驗分組、模型制作和給藥 Wistar大鼠60只隨機分為空白對照組、模型組、舒馬普坦組（6mg·kg－1·d－1）和正清風痛寧低劑量組（100mg·kg－1·d－1）、正清風痛寧中劑量組（150mg·kg－1·d－1）、正清風痛寧高劑量組（200mg·kg－1·d－1），每組10只。采用皮下注射NTG制作大鼠偏頭痛模型。Wistar大鼠稱質量后按10mg·kg－1皮下注射NTG，制作實驗性偏頭痛模型。模型制作判定標準：模型制作后通過耳紅、撓頭、爬籠和煩躁不安等行為癥狀判定模型制作是否成功。成功的標準為模型動物精神不振，眼睛瞇成線狀，體溫明顯下降，蜷縮少動，肛門處有糞便堆積，體質量逐日下降。本實驗中，除空白對照組外，其余各組動物造模后6～10min均出現雙耳發紅、前肢頻繁搔頭、擺頭、爬籠次數增多和煩躁不安現象。模型組大鼠上述現象持續1～3h，繼而出現蜷臥，活動減少狀態。造模30min后按組分別灌服舒馬普坦、各劑量正清風痛寧，模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。舒馬普坦和各劑量正清風痛寧組大鼠在給藥后上述現象逐漸消失，趨于正常。

1.3 取材和標本處理 造模4h后將大鼠用10%水合氯醛（0.30mL·100g－1）腹腔注射法進行全身麻醉后，仰臥固定，開胸從左心室至主動脈插管，剪開右心耳，首先迅速灌注無菌生理鹽水200mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200mL，灌注后斷頭，取出整個完整腦組織，4℃、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液浸泡后，去除硬腦膜、大腦，保留腦干、軟腦膜和蛛網膜，在4%PFA磷酸鹽緩沖液中固定24h，然后放入20%蔗糖－PBS液中，至組織塊下沉。標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，常規HE染色。

1.4 計數蛛網膜下腔炎性細胞數 切片HE染色，奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片腦干蛛網膜下腔炎的炎癥反應，計數腦干蛛網膜下腔40倍視野單位面積（以視野為單位）炎性細胞數總數。全部標本的切片均由2名有經驗的病理科醫師觀察復核。

1.5 免疫組織化學染色 常規HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結構未被破壞，采用免疫組織化學方法檢測TNF－α和IL－1β表達情況。奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片左上、右上、左下、右下和中央部5個視野40倍圖片，計數每個視野TNF－α和IL－1β陽性細胞總數，取均值。全部標本的切片均由2名有經驗的病理科醫師觀察復核。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計學分析。各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細胞數及蛛網膜下腔炎性細胞數以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細胞數顯微鏡下免疫組織化學染色陽性部位為細胞質染為棕黃色，細胞核用蘇木精復染為藍色。與空白對照組比較，模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細胞數明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，正清風痛寧中、高劑量組和舒馬普坦組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1和圖2（插頁六）。

2.2 各組大鼠腦干蛛網膜下腔炎性反應 空白對照組大鼠蛛網膜下腔血管正常，無血管擴張及炎性細胞浸潤；模型組大鼠腦干蛛網膜下腔血管明顯擴張充血，炎性細胞（以淋巴細胞、單核細胞為主）浸潤，炎性細胞數明顯增多，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；正清風痛寧低、中、高劑量組及舒馬普坦組炎性反應減輕，炎性細胞數（以淋巴細胞和單核細胞為主）明顯減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達陽性細胞數Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達陽性細胞數Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

0 2.90±0.745.70±2.31 Model 0 15.20±5.53＊19.20±4.69＊Sumatriptan 6 1.80±0.79△2.80±1.40△Zhengqingfengtongning Low dose 10010.10±2.6013.50±4.30 Middle dose 150 6.90±1.45△7.70±1.50△High dose 200 6.00±2.21△7.00±1.33 ositive cells Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of TNF－α positive cells Number of IL－1β p△

表2 各組大鼠腦干蛛網下腔炎細胞數Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

表2 各組大鼠腦干蛛網下腔炎細胞數Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.01 compared with model group.

0 1.90±0.74 Model 0 28.33±2.06＊Sumatriptan 6 11.00±1.05△Zhengqingfengtongning Low dose 100 9.10±1.10△Middle dose 150 5.60±0.97△High dose 200 2.60±0.84 ace Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of inflammatory cells of per unit area subarachnoid sp△

3 討 論

偏頭痛是一種原發性頭痛，是臨床常見病、多發病，其影響、困擾著全球總人口20%的人群，特別是20～50歲的女性［3］，年患病率女性為3.3%～32.6%，男性為0.70%～16.1%［4］。偏頭痛不但是神經科常見病，還是腦血管病的危險因素之一，與神經科許多疾病共患病，如焦慮癥、抑郁癥和癲癇等，但其發病機制目前尚無定論。三叉神經血管反射學說為目前的主流學說，該學說認為：三叉神經受損害、神經纖維受刺激導致腦膜ANI發生，誘發偏頭痛。三叉神經系統、神經肽和炎性介質在偏頭痛病理生理學中起關鍵作用［2］。細胞因子是重要的炎性介質之一，是炎性通路上的重要調質，與偏頭痛發病機制有關聯；細胞因子及其受體在中樞神經系統所有細胞類型、包括神經細胞中均表達［5］。細胞因子不僅在健康人大腦中產生，參與正常神經功能，而且在神經源性炎癥中起作用，是神經源性炎癥調質，誘導疼痛［6］，TNF－a和IL－1能夠引起強烈的痛覺過敏［5］。有報道［6］顯示：在偏頭痛患者偏頭痛發作期，血漿TNF－α水平升高。IL－1在偏頭痛患者中也被證實升高［7］。促炎性細胞因子TNF－α和IL－1β在調節疼痛中起到關鍵性作用，其有助于三叉神經纖維致敏［7］。在人體臨床試驗中TNF－α能夠引起頭痛，TNF－α抗體能減少疼痛。本實驗通過皮下注射NTG復制偏頭痛模型。注射NTG可引起大鼠硬腦膜遲發性炎癥反應，調節促炎性細胞因子IL－1β和IL－6產生。本實驗結果與前述的研究結果一致，TNF－α和IL－1β在模型組大鼠腦干中表達水平明顯升高。此外，本文作者的前期實驗［8］結果和本實驗觀察結果與何秋等［9］觀察的結果一致：模型組大鼠蛛網膜下腔有大量淋巴細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤，空白對照組大鼠蛛網膜下腔無明顯炎性反應。三叉神經血管反射學說認為：由于某種因素激活了腦膜血管周圍的三叉神經末梢，釋放某些神經肽，使腦膜血管舒張，產生ANI。ANI反應刺激中樞和三叉神經末梢釋放化學物質或炎癥介質，引起血管舒張、滲漏，造成疼痛的延長［10－12］，此過程包括神經源性炎癥、中樞痛覺致敏等偏頭痛病理生理過程。神經源性炎癥是偏頭痛疼痛產生的關鍵環節。本實驗結果證實：偏頭痛模型大鼠存在ANI反應，蛛網膜下腔炎性細胞增多和中樞促炎性細胞因子表達增多。

正清風痛寧主要成分是鹽酸青藤堿，是從中藥青風藤中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮痛、鎮靜和鎮咳等藥理作用。梁瑞燕等［13］通過體外實驗研究表明：青藤堿對IL－1β基因表達有較強的抑制作用，并認為青藤堿可能是通過抑制炎癥性細胞因子的產生而發揮其抗炎作用。另有研究［14］證實：青藤堿可通過抑制炎性細胞因子如IL－1β、IL－2、IL－8和TNF－α等的表達及合成而產生抗炎作用；青藤堿還能有效抑制巨噬細胞釋放IL－1及TNF－α，從而有效抑制了新一輪炎癥的啟動［15］。

綜上所述，青藤堿可抑制炎性細胞因子的表達和合成，從而減少炎性細胞因子所致的疼痛。曲普坦類藥物是一類特異性5－HT1B／1D受體激動劑，包括舒馬普坦等，是偏頭痛急性發作期的主要治療藥物。曲坦類藥物治療偏頭痛可能的機制：收縮已擴張的腦血管，減少神經肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛的血管炎癥反應，阻斷疼痛在三叉神經系統傳遞，抑制三叉神經血管系統致敏中樞［16－19］。這些反應均是偏頭痛疼痛發作的特征性特點。舒馬曲坦是第1個人工合成的選擇性5－HT（5－HT1B／1D）受體激動劑，其治療偏頭痛發作的作用機制：收縮特定的顱內血管，抑制激活突觸前膜的5－HT受體，抑制活化的三叉神經元放神經遞質和炎癥介質［20－21］。本實驗結果顯示：NTG可引起模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達及其蛛網膜下腔炎性反應明顯增多，舒馬普坦組和各劑量正清風痛寧組大鼠上述反應明顯減輕，但舒馬普坦組與各劑量正清風痛寧比較差異有統計學意義，各劑量正清風痛寧組大鼠蛛網膜下腔炎性細胞數比舒馬普坦組減少更明顯，且高劑量組與空白對照組比較無統計學差異，舒馬普坦抑制腦干中TNF－α和IL－1β表達明顯優于正清風痛寧組。本文作者推測：正清風痛寧有抑制實驗性偏頭痛模型大鼠ANI反應的作用，從而達到其在治療偏頭痛中的抗炎和鎮痛作用。有研究［22－23］證實：神經源性炎癥發生在人類偏頭痛中，但這一直是一個有爭議的領域。因此，需要更多的實驗數據來進一步證實上述實驗結果。

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