鄰苯二甲酸二丁酯對雄性小鼠生殖系統的脂質過氧化作用

吳冠宇，王 碩，劉 艷，趙淑華

（吉林大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室，吉林 長春 130021）

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一種運用廣泛的工業化學增塑劑，在受熱、磨損等條件下，PAEs會與塑料逐步分離擴散到環境或生物體內［1－3］。PAEs的毒性遠高于三聚氰胺，被列為主要的環境雌激素，是世界上最廣泛存在的污染物［4－6］。作為PAEs中應用最為廣泛的一種，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在土壤、大氣和水體中均有檢出［7］。其中，低相對分子質量的DBP多用于香水、化妝品等產品的生產加工；而高相對分子質量的DBP常添加于醫療器械、地板膠和墻面漆等產品中，用以增強材料的柔韌性［8－9］。我國已將 DBP確定為環境優先控制污染物［10］。有研究［11－14］表明：DBP 對雄性動物生殖和發育的影響包括精子生成障礙、睪酮合成量下降、胚胎畸形、睪丸標志酶活性下降和體質量減輕等，但其對生物體的干擾機制研究尚不充分。本實驗選擇小鼠為研究對象，通過檢測雄性小鼠生殖系統抗氧化酶的活性，觀察低劑量DBP對雄性小鼠生殖系統的脂質過氧化作用，探討其對小鼠生殖系統毒性作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康雄性ICR小鼠40只，體質量（18±2）g，購自吉林大學基礎醫學院動物中心提供，動物合格證號：SYXK（吉）2007－0011，動物合格證號：SCXK（吉）2007－0003。小鼠于實驗室適應性飼養3d后，隨機分組分籠飼養，自由攝入食物和飲水，飼養溫度18～24℃，相對濕度為50%～70%。DBP購自天津市光復精細化工研究所生產（純度99.5%、相對密度1.0463～1.0475g·mL－1），食用玉米油購自中糧食品營銷有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。TD5A臺式自動平衡離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），WS2－261－79型電熱恒溫水溫箱（北京醫療設備廠），722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠制造），FA1004型上皿電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 動物分組和給藥 將40只雄性ICR小鼠隨機分為對照組和200、400、800mg·kg－1DBP組，每組10只。以玉米油溶解DBP，對照組小鼠灌胃給予玉米油溶劑，其他各組小鼠根據半數致死量（LD50）為8000mg·kg－1分別灌胃給予200、400和800mg·kg－1DBP，每天1次，連續給藥2和4周，每天觀察小鼠一般狀況、飲食情況和活動情況、每天測量小鼠的體質量，根據體質量調整給藥量［15］。

1.3 觀察指標 分別于染毒后2和4周脫臼處死各組5只小鼠。取睪丸，稱質量，去被膜，冰浴下勻漿，離心，取上清。計算小鼠睪丸質量與體質量比值，即睪丸的臟器系數。按照試劑盒說明書操作，測定各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析處理。各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量和臟器系數 染毒2周后，各染毒組小鼠體質量無明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，800mg·kg－1DBP組小鼠體質量明顯高于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒期間，小鼠體質量變化見表1。染毒2周后，各組小鼠睪丸臟器系數無明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸臟器系數明顯低于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組小鼠體質量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

表1 各組小鼠體質量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Body weight（week）0 2 4 Control 22.19±1.3629.40±3.3232.70±3.32 DBP（mg·kg－1）200 23.25±1.2929.41±2.7832.34±3.07400 24.07±1.4530.90±2.1734.59±2.52800 23.74±1.6630.28±2.3635.71±2.39＊△

表2 各組小鼠睪丸臟器系數Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

表2 各組小鼠睪丸臟器系數Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Testis organ coefficient（week）2 4 Control 0.73±0.07 0.72±0.09 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.07 0.71±0.04400 0.73±0.11 0.62±0.07＊△800 0.64±0.02 0.60±0.05＊△

2.2 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平 染毒2周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸組織中MDA水平明顯高于對照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）；200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對照組（P＜0.05）。染毒4周后，200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組MDA水平均明顯高于對照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于200和400mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group MDA level in testis homogenate（week）2 4 Control 0.77±0.08 1.25±0.15 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.06＊ 1.04±0.11＊400 0.95±0.08＊△ 1.43±0.12＊△800 1.12±0.07＊△# 1.80±0.13＊△#

2.3 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD活性 染毒2周后，200mg·kg－1DBP組SOD活性明顯高于對照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組SOD活性 明 顯 低 于 對 照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組SOD活性低于200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒4周后，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對照組及200、400mg·kg－1DBP組（P＜0.05），其余各組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group Activityof SOD（week）Activityof GSH－Px 2 4 Control 6.97±0.93 27.53±2.21 34.72±2.97 17.2 471±0.99 DBP（mg·kg－1）200 7.65±0.64＊ 26.84±2.64 18.26±1.05＊ 25.09±1.96＊400 6.21±0.40△ 25.91±2.67 19.74±1.86＊ 29.42±3.66＊△800 5.67±0.54＊△ 19.69±2.47＊△# 20.02±1.71＊ 24.66±1.38＊#

2.4 各組小鼠睪丸組織勻漿中GSH－Px活性 染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對照組（P＜0.05），各染毒組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯高于對照組（P＜0.05），且400mg·kg－1DBP組GSH－Px活性明顯高于200和800mg·kg－1DBP組（P＜ 0.05）。見表4。

3 討 論

氧自由基的堆積可使細胞膜發生脂質過氧化反應，產生大量的MDA。MDA作為脂質過氧化物的最終產物，其水平不僅反映出機體內自由基產生的多少，也反映出脂質過氧化的程度，并間接反映細胞受損傷的程度［16］。本實驗中，400和800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于對照組，并且隨著染毒時間、劑量增加，MDA水平明顯升高，表明DBP可誘導小鼠睪丸內的脂質過氧化；而200mg·kg－1DBP組MDA水平較對照組明顯下降，可能是DBP在誘導脂質過氧化的同時也啟動了抗氧化系統，使機體處于代償狀態，也可能DBP抑制了體內的氧化還原過程。

正常情況下，機體所產生的自由基會迅速被體內酶系統清除，從而將自由基對機體的毒作用降至較低水平。機體中的抗氧化酶主要有SOD和GSH－Px。SOD為淬滅自由基的酶，并有終止自由基連鎖反應，保護細胞的作用［17－18］。本研究結果顯示：染毒2周時，各染毒組小鼠睪丸組織中SOD活性出現波動，4周時，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對照組及其他各染毒組。可能2周時DBP產生的過氧化自由基消耗了SOD；而4周時機體產生的酶的量和活性均明顯上升，與對照組比較差異無統計學意義，但800mg·kg－1DBP組可能產生的脂質過氧化的量較多而使SOD明顯消耗。

GSH－Px是機體主要的含巰基過氧化酶，其主要是以GSH為基質催化自由基的清除和過氧化物分解。在滅活大量產生的活性氧過程中，GSH－Px可能有過多的消耗而導致其活性下降。王玉邦等［19］在研究DBP對大鼠脂質過氧化的影響時發現：睪丸組織勻漿中GSH－Px在染毒2周后呈現上升趨勢，800mg·kg－1DBP組與對照組比較差異有統計學意義，而在染毒4周后，各組間比較差異無統計學意義。在本實驗中，染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對照組；而染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯升高，與文獻［19］報道的結果不同，這可能與體內的脂質過氧化作用對酶活性產生的干擾有關聯，也表明DBP對生物體的脂質過氧化作用存在種屬間的差異［20－21］，其機制有待進一步研究。

本實驗中，各組小鼠體質量無明顯差異，但染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組睪丸臟器系數明顯下降，可能與睪丸組織的氧化損傷有關聯。

綜上所述，DBP可誘導小鼠睪丸產生脂質過氧化反應，誘導氧化應激，并干擾抗氧化酶的活性，最終可能造成生殖功能損傷。

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