鹽酸異丙腎上腺素誘發大鼠心肌缺血性纖維化后肝臟損傷的拉曼光譜分析

黃宇欣，高海成，劉 凱，苗春生

（1.吉林大學理論化學研究所 理論化學計算國家重點實驗室，吉林 長春 130012；2.長春工業大學基礎科學學院物理教研室，吉林 長春 130012；3.吉林大學藥學院臨床藥學教研室，吉林 長春 130021）

國內外文獻［1－4］報道：皮下注射大劑量鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，Iso）會導致大鼠急性心肌缺血損傷，這種損傷與人的急性心肌缺血較為相似，可作為評價藥物抗心肌缺血的動物模型。而Iso在誘發心肌缺血性纖維化的同時，能否造成其他臟器的損傷，目前國內外少有報道？如果造成其他臟器的損傷，可通過什么方法檢測。近年來，拉曼光譜正逐漸出現在人們的視野。國外文獻［5－8］報道：拉曼光譜在聚合物、生物分子、蛋白質和無機物等方面得到了廣泛的應用。本實驗利用Iso誘發大鼠心肌缺血模型，通過紫外和拉曼光譜分析Iso誘發心肌缺血性纖維化后肝臟的損傷，旨在為今后藥物對各器官損傷的檢測提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器 雄性 Wistar大鼠20只，合格證號：SCXK（吉）2008－0005，體質量180～220g，由吉林大學實驗動物中心提供。Iso注射液由上海禾豐制藥有限公司生產。MD－100自動生化分析儀（美國），徠卡4215切片機（德國），Olympus PM－10AO全自動顯微照相裝置（日本Olympus公司）。

1.2 實驗動物分組及建模 實驗分為對照組及Iso組（包括4h、24h及1周組）。除對照組使用生理鹽水刺激外，其余各組一次性皮下多點皮下注射Iso 15mg·kg－1。通過HE染色評價模型。

1.3 肝臟和心臟組織的HE染色 分別在注射Iso后4h、24h和1周時剖腹取大鼠心臟，經10%甲醛固定30min，常規石蠟包埋。用二甲苯脫臘10min，用100%乙醇置換二甲苯2min、95%乙醇置換1min、80%乙醇置換1min及用75%乙醇置換1min，蒸餾水沖洗2min。蘇木素染色5min，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30s。自來水浸泡15min。伊紅染2min。常規脫水，透明，封片，拍照。

1.4 紫外吸收光譜 心臟和肝臟組織經蛋白提取液勻漿后，通過UV－2450光譜在200～1000nm處檢測勻漿液的吸收，由此分析心臟和肝臟蛋白吸收譜（nm）。

1.5 拉曼光譜 肝臟組織經蛋白提取液勻漿后，通過拉曼光譜在1400～1700cm－1處檢測勻漿液的吸收，由此分析肝臟蛋白吸收譜（cm－1）的變化。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌細胞病理學 對照組大鼠心肌排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無細胞腫脹。Iso－24h組大鼠心肌出現較多的壞死，局限于心內膜下。Iso－1周組大鼠心肌出現界限清晰、多發散在壞死灶，壞死灶內有旺盛的成纖維細胞增生，并可見一定量的膠原纖維［9］。見圖1（插頁七）。

2.2 紫外檢測心臟組織成分 對照組出現3個明顯的吸收峰，波長分別是0.891、0.799和0.433，其吸收峰值分別是539、576和972nm。Iso－24h組峰位移動，吸收峰值向左或向右移動1個單位。Iso－1周組由1個峰位趨于正常。見圖2。

2.3 紫外檢測肝臟組織成分 對照組大鼠肝臟組織標本在968nm檢測時發現有較明顯的吸收峰，其吸收值是0.615；Iso－4h組吸收峰位未改變；Iso－24h組峰位是966nm，與對照組比較，移動了2個單位。Iso－1周組吸收峰位逐漸趨于平穩。見圖3。

圖2 各組大鼠心臟組織的紫外吸收光譜結果Fig.2 Results of UV absorption spectrometry in heart tissue of rats in various groups

圖3 各組大鼠肝組織紫外光譜結果Fig.3 Results of UV absorption spectrometry in liver tissue of rats in various groups

2.4 拉曼光譜法檢測肝組織成分 對照組大鼠肝臟組織在1589nm處可見明顯的吸收峰。Iso－24h組在1590nm處見明顯的吸收峰；Iso－1周組未檢測到相同的峰位。見圖4。

圖4 各組大鼠肝臟組織拉曼光譜結果Fig.4 Results of Raman spectra in liver tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠肝組織病理學 肝組織病理學觀察可見：對照組大鼠肝小葉界限清晰，無壞死灶；Iso各組大鼠肝小葉內有灶性壞死區，肝細胞出現水樣變性；隨著Iso注射時間的延長，肝臟病變程度加重。見圖5（插頁七）。

3 討 論

肝臟是人體最大的內臟器官，質量為1.0～1.5kg［10］。肝臟由專門的細胞組成（如肝細胞、枯氏細胞和肝星狀細胞），各類細胞在肝臟中均有重要的作用［11－12］。人體中最重要的代謝是蛋白質、碳水化合物和脂肪代謝，膽汁分泌、膽紅素的排泄、礦物質（鐵）和糖原、細菌和抗原等均在肝臟代謝中起作用［13－14］。心肌缺血是一種非常普通的心血管疾病。當發生缺血時，是否同時會造成肝臟的損傷已引起關注。

拉曼光譜技術是一種非破壞性的指紋成像技術。現已在材料、化工、生物醫學和環保等領域有著廣泛的應用。而根據拉曼光譜技術所發展起來的表面增強拉曼光譜技術（surface－enhanced Raman spectra，SERS）也在溶劑檢測中得到了普遍的應用［9］。拉曼光譜可在不損傷細胞的條件下實時動態地監測細胞分子結構變化，亦可獲得細胞的 “分子指紋”，具有敏感性高、實時檢測、活樣品不需固定或染色和不損傷細胞等眾多特點。近年來，國內外研究者將拉曼光譜應用于細胞藥物處理、細胞水平疾病診斷、單細胞生命活動監測、亞細胞結構等研究，取得了不同程度的進展。隨著研究的深入，拉曼光譜分析技術必將在細胞、癌癥研究、細胞分選和藥物篩選等領域廣泛應用［8］。在本實驗中，HE染色結果顯示：Iso在給藥后4和24h誘發了大鼠心肌缺血，且24h時出現較多的點狀壞死，在1周時出現纖維組織增生和纖維化；而紫外光譜分析顯示：心肌蛋白譜右移1個單位，這些結果說明Iso誘發了大鼠心肌的損傷；而Iso誘發心肌缺血性纖維化的同時，紫外光譜分析顯示肝臟蛋白譜右移1個單位；HE染色結果則顯示肝臟組織中細胞堆積，成分增多；拉曼光譜分析顯示：肝臟組織蛋白譜在4h～1周內右移3～6個單位，這些結果說明Iso誘發心肌損傷的同時，誘發了肝臟的損傷。

綜上所述，Iso在4h、24h和1周誘發心肌損傷的同時，亦可能引發了肝臟的損傷。利用拉曼光譜檢測更為敏感，紫外吸收譜也可檢測到其損傷的相應特征。

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