馬氏珠母貝兩個與生長性狀相關QTL的驗證

韋國建 , 劉文廣 林堅士 何毛賢

(1. 中國科學院 熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室, 廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 中國科學院 南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學院大學, 北京100049)

水產養殖動物的多數重要經濟性狀例如生長、抗逆和肉質等都是數量性狀, 不僅由多個基因控制,且易受環境等因素的影響[1]。挖掘數量性狀位點(Quantitative trait locus, QTL)的最終目的是利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記進行分子標記輔助選擇育種(marker-assisted selection, MAS), 從而促進對性狀的遺傳改良[2]。目前遺傳連鎖圖譜構建和 QTL定位在水產養殖動物中取得了較大的進展, 但是這些QTL一般是基于單個家系小樣本量作圖獲得的,QTL區間過大, 導致QTL的檢測效率和對QTL效應的評估發生偏離[3]。因此對挖掘到的 QTL作進一步的驗證和鑒定是實施MAS的前提。QTL驗證最簡單的方法是比較QTL位點不同等位基因的表型差異[3-4]。目前對 QTL定位結果進行驗證的報道還不是很多,在尖吻鱸[5]、虹鱒[6-8]、鯉魚[9-11]、大西洋鮭魚[12]和牙鲆[13-14]等少數魚類的生長和抗病 QTL進行了確認,并且已有少數QTL結果應用于指導實踐育種[12,14-16]。而在海洋貝類, 還極少見對 QTL進一步驗證和應用的報道。

馬氏珠母貝(Pinctada martensii)是重要海水養殖貝類。最近, 利用遺傳圖譜獲得了與其生長性狀連鎖的QTL標記, Shi等[17]應用2b-RAD測序技術, 利用3117個SNP標記構建了馬氏珠母貝遺傳圖譜, 獲得6個與總重、殼長、絞合線和珍珠層厚度相關的QTL。Li等[18]利用 RAD測序構建遺傳圖譜獲得與馬氏珠母貝殼高、殼長、殼寬、殼重、軟體部重、絞合線和總重7個生長性狀連鎖的QTL。但目前還沒有對這些QTL作進一步的驗證和應用。本研究用2個不同遺傳背景的馬氏珠母貝群體對其中兩個QTL(154165和 m59)進行驗證, 評估 QTL不同基因型與生長性狀的相關性, 旨在獲得真實穩定的 QTL結果, 為開展基于QTL結果的MAS奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗群體

本實驗所用的馬氏珠母貝(Pinctada martensii)來自深圳養殖群體(211只)和湛江養殖群體(111只), 均為2貝齡, 來源于同期貝苗, 養殖于深圳大鵬澳海區,以同樣的管理條件及相同的養殖密度進行養殖。用游標卡尺測量并記錄每只貝的殼高、殼長和殼寬, 精確到0.01 mm; 用電子天平稱量每只貝的總重, 精確到0.01 g。分別取每只貝的鰓組織置于95%的乙醇中,–20℃保存。

1.2 基因組DNA的提取

使用 DNA提取試劑盒(Hipure Universal DNA Kit)提取鰓組織的基因組 DNA, 相關操作參照試劑盒說明書。提取DNA后, 于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性; 并用分光光度計檢測其純度及濃度。提取的DNA于–20℃保存。

1.3 引物設計

已獲得的 QTL連鎖標記所在的序列為短序列,其長度無法用來設計引物。因此以連鎖標記的序列為源序列, 在已公布的馬氏珠母貝基因組草圖(http://marinegenomics.oist.jp/)和本實驗室已有的馬氏珠母貝轉錄組數據庫中進行Blast比對, 找出與之匹配的序列。根據匹配的序列和QTL標記SNP位置, 利用Primer Primer5.0軟件和Tetra-primer ARMS在線引物設計程序(http: //primer1.soton.ac.uk/primer1.html)設計每個 QTL標記 SNP基因分型的特異引物(表 1)。

表1 QTL位點SNP分型引物Tab.1 Primer used for analysis of QTL in pear oyster Pinctada martensii

1.4 PCR擴增

采用等位基因特異 PCR(AS-PCR)法對樣品的QTL標記SNP進行基因分型。15 μL的PCR反應體系為: 1.5 μL10×PCR buffer, 1.5 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L), 0.15 μLTaq DNA 聚合酶(5 U/μL), 1μL內 引 物(10 μmol/L), 0.5μL 外 引物(10 μmol/L),0.5 μLDNA, 8.35 μL ddH2O。反應程序為: 94℃預變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s,30個循環; 最后 72℃延伸 5min。PCR反應產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 統計分析

用 SPSS19.0軟件中一般線性模型(GLM)進行QTL連鎖標記SNP及其二倍型與馬氏珠母貝生長性狀的關聯性。采用Duncan,s多重比較分析各基因型、二倍型差異的顯著性, 差異顯著為P<0.05。方差分析的數學模型為:Yij=u+GiorDi+eij, 其中Yij表示基因型為i的第 j個個體的指標,u表示總體均值,Gi表示第i種基因型的效應,Di表示第i種二倍型的效應eij表示隨機誤差變量。

2 結果與分析

2.1 QTL連鎖標記與生長性狀的驗證

m59和154165QTL標記在湛江養殖群體和深圳養殖群體中都可檢測出3種基因型。經SPSS19.0軟件的一般線性模型(GLM)分析, m59標記在湛江群體中與殼高、殼長、殼寬和總重關聯顯著(P<0.05)(表2),其中GT基因型的殼高、殼長、殼寬和總重顯著高于GG 基因型的個體, 分別高出 8.9%、5.63%、8.09%和21.38%(表3); 在湛江群體中進行驗證也得到類似的結果, 該位點與殼高、殼長、殼寬和總重4個生長指標關聯顯著(P<0.05)(表2), 其GT基因型的個體的殼高、殼長、殼寬和總重比 GG基因型個體分別高出10.95%、11.41%、11.90%和26.67%(表3)。

154165位點在湛江群體中與殼高關聯顯著(P<0.05)(表2), GG、AG基因型的個體殼高均值顯著高于基因型為 AA的個體, 分別高出 9.24%和5.87%(表 3); 而在深圳群體中與殼高關聯不顯著(P>0.05), 卻與殼寬關聯顯著(P<0.05)(表2), GG基因型的個體殼寬均值顯著高于AG和AA基因型的個體, 分別比 AG和 AA基因型個體高 17.14%和18.06% (表 3)。

2.2 QTL連鎖標記SNP二倍型構建及生長性狀的關聯分析

為了進一步研究這兩個QTL連鎖標記SNP與生長性狀的整體作用, 基于這兩個QTL在這2個群體分別構建二倍型。統計分析發現, 在湛江群體中, 雖然二倍型C1型(AAGT)和C2型(GGTT)在殼高、殼長和總重顯著高于C5型(AAGG), 但由于二倍型C2在殼寬與二倍型C5沒有顯著性差異, 因此二倍型C1對馬氏珠母貝的生長最為有利(表 4); 在深圳群體中, 統計分析發現這5種二倍型與馬氏珠母貝的殼高、殼長、殼寬、總重關聯顯著(P<0.05), 二倍型為 D1(AGGT)和D2(AAGT)型的馬氏珠母貝在4個生長性狀指標顯著高于D4(AAGG)和 D5(GGTT)型(P<0.05), 二倍型 D1(AGGT)和D2(AAGT)的 4個生長性狀沒有顯著差異(P>0.05), 且個體最大, 可作為優選的基因型組合(表4)。

表2 馬氏珠母貝QTL連鎖標記與生長性狀的GLM分析Tab.2 Association analysis of QTL and growth traits in Pinctada martensii using GLM

表3 馬氏珠母貝2個QTL位點不同基因型多重比較Tab.3 Multiple comparison of growth traits in Pinctada martensii at two QTL loci

表4 QTL連鎖標記SNP二倍型與馬氏珠母貝生長性狀的關聯分析Tab.4 Associations between diplotypes of QTL and growth traits in Pinctada martensii

3 討論

目前, 雖然開展了遺傳連鎖圖譜構建及QTL定位的水產養殖動物多達幾十種, 但是將 QTL結果應用于遺傳改良中的研究還是較少[19], 比較典型的成功例子是牙鲆抗病淋巴囊腫病(LD)、大西洋鮭魚抗傳染病胰腺壞死病(IPN)的輔助選育中[12,14]。相對于抗病相關的 QTL結果, 生長性狀更容易受到環境因素的影響, 具有數量性狀的遺傳特征, 在一個群體或者家系中定位到的QTL可能不適用于另一個家系或者群體。因此如何驗證這些 QTL, 進而利用與性狀緊密連鎖的QTL標記進行性狀的遺傳改良將是下一個階段的研究重點。

研究表明, 用不同遺傳背景、不同發育階段以及不同養殖環境的群體或者家系獲得的QTL間存在共享 QTL和特異 QTL。Rexroad等[20]在虹鱒 Omy16連鎖群上定位到1個皮質醇濃度連鎖的極顯著QTL區間, 同時發現與 3個虹鱒家系的皮質醇濃度具有相關性, 而與另外 4個家系的皮質醇濃度不相關;Laghari等[21]定位到與鯉魚3個不同階段體重相關的QTL, 在第6連鎖群上的1個QTL與3個階段的體重都相關的 QTL, 而不同階段也有特異的 QTL存在。Wang等[5]在2個不同遺傳背景的群體中對生長性狀QTL進行驗證, 發現連鎖群LG2上的QTL標記 Lca371在 2個群體中與體重具有顯著的相關性,而其他QTL僅在一個家系表現出與性狀的相關性。本文使用 2個不同遺傳背景的馬氏珠母貝群體對154165和m59標記進行驗證, 發現m59標記在這2個群體中為共享QTL, 且該位點的GT基因型個體的生長性狀(殼高、殼長、殼寬和總重)顯著高于GG基因型的個體, 為馬氏珠母貝生長優勢基因型, 而154165標記為特異 QTL, 即在湛江群體中與殼高相關性顯著, 在深圳群體中與殼寬相關性顯著。這一結果與 Wang等[5]驗證尖吻鱸的 QTL結果類似。這 2個QTL的效應大小在2個群體中不一樣的原因可能是不同遺傳背景下QTL的等位基因頻率不相同。出現這些特異的 QTL 的原因可能是生長性狀受到QTL間的上位性效應的影響[22]以及QTL和環境互作的影響。在雞的下頜骨研究中也發現QTL間的上位性互作效應對生長性狀的表型值具有重要的作用[23]。

Shi等[17]在 6個生長性狀中定位到的 m59只與珍珠層厚度相關, Li等[18]定位到的QTL154165與總重和殼重相關, 雖然有一些性狀指標在本研究中沒有檢測, 但在本研究中顯著關聯的性狀仍與這兩篇文獻的報道存在一定的差異。造成這種差異的原因可能是: 定位到的這些 QTL一般是通過特定家系作圖獲得, 獲得的 QTL結果可能不適合用于另一個家系或者群體; QTL作圖時在LOD臨界值下錯誤的判斷有 QTL存在而出現假陽性; 表型分型不夠準確也會增加實驗誤差。孫效文等建議將QTL結果應用育種之前最好在大樣本量的隨機群體中進行驗證, 以增加QTL在育種群體中的利用價值[24,25]。本文利用2個不同遺傳背景的群體對通過遺傳圖譜獲得的馬氏珠母貝生長性狀QTL進行驗證, 對實施MAS有著重要的意義。

單獨的SNP標記進行性狀關聯分析提供的信息往往是有限的, 通過構建二倍型可以提供更豐富的遺傳信息來彌補單獨 SNP 的缺陷[26-28]。García- Magari?os 等[29]發現人類一些復雜疾病可能與SNP-SNP相互作用有關; 在鯉魚IGF-I基因中的單個 SNP位點 g.7722T>C與生長性狀關聯不顯著(P>0.05), 但是當SNP g.7627T>A和g.7722T>C結合時, 發現二倍型(TTTT)個體的體重、體長和 K值均顯著小于其他二倍型(P<0.01)[30]; Cong等[31]研究長牡蠣IRR基因上的2個SNP標記構建的5個二倍型中, 發現二倍型D3(GGTT)是對長牡蠣的生長最為有利。在本研究中, 基于2個QTL連鎖標記SNP分別在湛江和深圳群體中構建二倍型, 發現二倍型(AAGT)在湛江和深圳群體中對馬氏珠母貝的生長最為有利的基因型組合。這一結果表明m59位點的GT基因及與其他位點基因型結合可能有利于馬氏珠母貝的生長。此外, 在深圳群體中二倍型D1(AGGT)也是對馬氏珠母貝生長最為有利的二倍型之一, 而在湛江群體中沒有出現此二倍型類型的個體, 出現這種現象的原因可能有用驗證的兩個群體的數量大小有差異, 從而引起等位基因頻率在不同的群體中不一樣, 基因型組合的類型也不一樣;群體間存在特異QTL也是原因之一。

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