不同生長時期蝦夷扇貝殼質的超微結構觀察及表面 5種元素組成分析

龐云龍, 丁 君, 田 瑩, 郝振林, 常亞青

(大連海洋大學 農業部北方海水增養殖重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)屬軟體動物門(Mollusa)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞綱(Pterimorphia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae), 為冷水性種, 自然分布于日本海、俄羅斯遠東海域, 自20世紀80年代初由日本青森縣陸澳灣引入中國海域, 目前已成為中國北方沿海地區重要的養殖經濟貝類之一[1]。蝦夷扇貝左殼小而平、呈紅褐或紫褐色, 右殼稍大而凸、呈白色, 近些年也發現左右殼均呈白色的個體, 并且表現出一定的優勢[2-3]。目前對蝦夷扇貝的研究主要集中在生產養殖[4-5]、群體遺傳多樣性和種質[6-7]、蛋白質組學[8]、營養成分等方面[2,9]。關于蝦夷扇貝殼超微結構的相關研究極少報道。

雙殼類的殼壁從殼質成分上可分為有機質層和無機質層(即碳酸鈣層)兩部分, 有機質層覆于殼體最表面, 故稱表殼層(Periostracum), 表殼層的作用首先是保護殼體的鈣質部分。鈣質部分結構就是通常所稱的殼質結構[10]。鈣質層一般可分為三層: 外殼層(outer layer), 中殼層(middle layer), 和內殼層(inner layer)[10-11]。雙殼類外殼層包括均質結構和葉狀結構, 成分為方解石; 中殼層由文石結構組成, 包括片狀結構和棱柱結構; 內殼層為片狀結構部分葉狀結構。本實驗所使用殼質結構的專業術語參考陳金華[10]和 Carter[12]。

貝殼的殼質結構研究由光學顯微鏡的使用而開展[13]。隨著電子顯微鏡技術的發展, 20世紀60年代后期, 主要應用掃描電子顯微鏡對殼質結構進行分析研究。目前國內外關于軟體動物殼質超微結構的報道較少, 梁艷[14]研究了腹足綱香螺貝殼在生長過程中不同時期的殼體材料結構及力學性能; 馮偉民[15-16]對陸棲肺螺類與半咸水螺殼的殼質超微結構進行了對比研究, 闡述了腹足類個體發育中殼質結構的變化; Younis[17]研究了長刺古螺(Murex troscheli)殼質的原子結構和超微結構; West[18]對淡水腹足類殼質超微結構做了相關研究。Dauphin[19]對6種雙殼類和腹足類殼的化學組成以及超微結構做了詳細研究; Villagran[20]利用掃描電鏡技術觀察到紫貽貝(Mytilus edulis)經過風化作用后產生了一種新的殼質結構。為探究不同生長時期蝦夷扇貝的殼質結構, 本實驗以大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室培育的不同生長時期的蝦夷扇貝作為實驗材料,使用掃描電鏡觀察了不同月齡貝殼的超微結構, 明確了不同發育階段蝦夷扇貝的殼質結構類型, 以期為豐富雙殼貝類的殼質結構積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用蝦夷扇貝取自大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室培育并吊養的已明確月齡的(5月齡、7月齡、9月齡、12月齡、18月齡、30月齡)蝦夷扇貝(圖1)。其中5月齡樣品分為紅殼和白殼2種, 共計7種, 每種隨機取5只觀測。貝殼表型信息如表1所示。

圖1 不同時期蝦夷扇貝左殼Fig.1 The left valve of Patinopecten yessoensis at different ages

表1 不同生長時期蝦夷扇貝形態指標測量Tab.1 The morphological index of Patinopecten yessoensis at different ages

實驗所用儀器: 超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司產品), 多功能臺鋸(永康市新紀元工貿有限公司產品), 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司產品), 掃描電鏡(德國ZEISS上海有限公司產品)。

實驗在大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室進行樣品處理, 在大連海事大學進行電鏡觀察。

1.2 方法

本實驗的步驟和樣品處理方法采用 Carter方法并略有改進[21], 具體操作步驟如下:

將樣品用毛刷將貝殼表面的泥土和附著物刷洗干凈, 對樣品經行編號、拍照, 然后沿貝殼殼頂中心點至殼口中點進行切割, 切割后得到貝殼的兩個截面, 距殼頂每隔1 cm取樣, 大小規格約為1 cm×1 cm。將切割得到的剖面用 800目的玻璃進行打磨, 每個剖面打磨至少1 min。把樣品放入超聲波震蕩清洗儀中清洗。每件樣品清洗 30 s左右。清洗之后, 將樣品放入1%的過氧化氫(H2O2)溶液中浸泡, 約3 h, 在放入超聲波震蕩清洗儀中清洗, 30s。清洗后的樣品用鑷子取出放入恒溫干燥箱中烘干, 45℃, 48 h。先在顯微鏡下觀察殼質結構是否清晰, 如果能夠清晰展示,則繼續下一步。如不能則重復步驟4～9。將準備好的樣品用鑷子放置在電鏡紐扣上, 噴金, 在掃描電鏡下進行觀察實驗結果, 同時通過掃描電鏡的能譜成分分析功能對殼表面元素組成和含量進行測定。

2 結果

2.1 蝦夷扇貝殼質結構類型

雙殼類的殼質超微結構呈多層分布, 組成這些層的晶體排列方向和礦物成分不盡相同。蝦夷扇貝從礦物成分上可分為2種: 文石(aragonite)和方解石(calcite)。從殼質結構上可以分為 4種主要類型: 均質型結構(homogeneous)、葉狀型結構(foliated)、交錯片狀結構(crossed lamellar)、棱柱型結構(prismatic),均質結構又可分為均質型結構(homogeneous)和顆粒狀均質結構(granular homogeneous)。葉狀型結構根據首級片體的結構模型可分為交錯葉狀結構(crossed foliated)、規則葉狀結構(regular foliated)和不規則葉狀結構(irregular foliated)。交錯片狀結構分為交錯片狀結構(crossed lamellar)和復雜交錯片狀結構(complex crossed lamellar)。蝦夷扇貝左殼縱切面掃描電鏡圖片見圖2。

圖2 蝦夷扇貝左殼縱切面掃描電鏡圖片Fig.2 SEM photomicrographs showing the vertical section of the left valve of Patinopecten yessoensis

2.1.1 均質型結構(homogeneous)

殼質結構最外層是很薄的方解石結構, 位于葉狀型結構之上。通過觀察不同的樣品可以將均質型結構分為上下 2種亞層, 上層結構為均勻致密亞層,如圖 2C、2D(上)。下層結構為顆粒狀亞層, 如圖2D(下), 由不規則的晶體構成, 大小不一。

2.1.2 葉狀型結構(foliated)

葉狀結構是由 3個層級的片體構成, 3級片體laths(third-order lamella)構成次級片體 sheets (second-order lamella), 首級片體(first-order lamella)由次級片體構成。根據首級片體的結構模型又可以將葉狀結構分為以下幾種類型。

交錯葉狀結構(crossed foliated) 通常分布在最外層均質結構下面的一層方解石結構, 首級片體的方向一致。交錯排列。如圖2E。

規則葉狀結構(regular foliated) 具有相同的傾斜角度的片狀方解石結構。規則葉狀結構在殼的外層, 和殼內層均有分布。殼外層的規則葉狀結構與交錯葉狀結構相接, 圖 2F; 殼內層的規則葉狀結構位于交錯片狀結構之下, 如圖2G。

不規則葉狀結構(irregular foliated) 分布具有區域性, 在局部分布廣泛。首級片體沒有固定的方向性, 與前 2種葉狀結構的區別在于它的形狀不規則,樹杈狀排布, 而且明顯小于前 2種結構, 如圖 2H。在分布上這 3種結構通常是過渡式的排列, 由外向內為交錯葉狀結構過渡為規則葉狀結構, 再到不規則葉狀結構, 如圖2F。

葉狀結構的分布大致可分為 2種情況: (1)分布在較外層, 均質結構之下, 貫穿整個貝殼, 規則葉狀結構從殼頂延伸至殼腹緣, 交錯葉狀結構覆在其上面, 從腹緣至背緣逐漸變薄。(2)內層的規則葉狀結構分布在片狀結構之下, 是貝殼內層的主要結構。內外兩部分只有在殼頂區域才有接觸。

2.1.3 交錯片狀結構(crossed lamellar)

交錯片狀的首級片體由互相平行的文石晶體聚集而成。在相鄰的首級片體中, 次級片體長軸可能在兩個相反的方向上交替排列。復雜交錯片狀結構(complex crossed lamellar)更加復雜, 在三個或者更多的方向上分布排列。這種排列方式可以增加殼的抗擊能力。交錯結構被棱柱結構分隔為上下兩個亞層, 棱柱結構上面的交錯片狀亞層的首級片體長而且形狀規則, 如圖 2J, 最顯著的特征是分支狀的首級片體; 內部交錯片狀亞層主要是復雜交錯片狀結構, 與外部亞層相比首級片體較短, 而且形狀更加不規則, 如圖2K。

2.1.4 棱柱型結構(prismatic)

棱柱結構是由長條形的棱柱構成, 楔形或 V字形, 長遠大于寬, 成分為文石。如圖 2B。棱柱形狀簡單, 邊界筆直或不規則, 直徑1～3 μm。棱柱結構分布在交錯片狀結構和復雜交錯片狀結構之間, 厚度從閉殼肌痕處向四周呈散射狀逐漸變薄。

2.2 不同時期蝦夷扇貝的殼質結構組成

殼頂是貝殼發生的最初點, 也被稱作胎殼。本實驗以不同生長階段的蝦夷扇貝為實驗材料, 距殼頂每隔1cm取樣進行電鏡觀察。分析不同階段的扇貝所具有的殼質結構類型, 結果見表2。5月齡的殼質結構組成種類較少, 包括3種結構類型, 即均質結構、葉狀結構、交錯片狀結構。7～30月齡的殼質結構類型組成基本保持穩定, 但也存在差異, 如復雜交錯片狀結構只在18月齡和30月齡中出現。

2.3 同一時期不同殼色蝦夷扇貝的殼質元素組成

本實驗分析了不同殼色蝦夷扇貝殼表面的化學元素組成。對5月齡蝦夷扇貝“象牙白”品系和普通紅褐色蝦夷扇貝的貝殼表面 5種化學元素含量進行了分析。如表3和表4。結果表明: 除Ca外, “象牙白”品系和普通紅褐色貝殼所含的C、O、Na、Mg 4種元素比例差異較小, 而Ca元素的含量在2種貝殼中的差異較顯著。從表中可以看出O、C、Ca 3種元素在貝殼中的含量均較高, 其中 O元素含量的百分比在2種貝殼中均顯示最高, 分別為60.44%和56.48%;Mg元素含量的百分比均顯示最低, 分別為0.48%和0.36%。

表2 不同時期蝦夷扇貝殼質結構Tab.2 Shell structure at different ages

表3 “象牙白”外殼表面元素分析Tab.3 The shell surface elemental analysis of “Ivory”strains of Patinopecten yessoensis

表4 普通紅褐色蝦夷扇貝外殼表面元素分析Tab.4 The shell surface elemental analysis of ordinary individuals

3 討論

3.1 不同生長時期殼質超微結構類型比較分析

研究不同月齡貝殼殼頂處的超微結構發現, 隨著月齡的增長, 殼質超微結構的主要類型稍有差異,但基本保持穩定。實驗觀察到 5月齡殼質結構類型較少, 主要由均質結構、規則葉狀結構和交錯片狀結構構成, 而均質結構和規則葉狀結構所占的比例很少, 均質結構僅分布在貝殼的表層下部, 規則葉狀結構只出現在殼內層的部分區域, 貝殼中間很大一部分是交錯片狀結構。出現這種現象的原因可能是由于交錯片狀結構具有很強的抗裂碎能力, 5月齡的幼貝殼體尚小, 為了增加自身的貝殼抗擊能力, 從而有效的防止物理損傷而導致死亡。我們還觀察到復雜交錯片狀結構只出現在18月齡和30月齡, 復雜交錯片狀結構是交錯結構的一種, 但它的首級片體交錯方式更加復雜, 形狀更加不規則, 因此復雜交錯片狀結構使得此時的貝殼具有更強的抗擊能力和抗磨損能力。馮偉民在觀察腹足類殼質超微結構時也提出了相似的觀點[16]。

同時, 觀察到隨著殼體發育, 會突然出現增生新的超微結構層的現象, 如圖2I, 在觀察18月齡蝦夷扇貝樣品時, 棱柱結構結構(3)和交錯片狀結構(1)中間, 新生成一層交錯片體結構(2), 它的首級片體比交錯片狀結構短, 但排列形式卻比復雜交錯片體規則。相似的研究結果也有見報道, Bandel在Seguenzia中的第2螺層和第3螺層中發現了這種情況[22]。

此外, 通過反復比對發現, 隨著生長時期的增加, 殼質結構逐漸趨向于復雜, 葉狀結構和交錯片狀結構的比例增加, 如圖2G和圖2J所示。片狀結構的礦物成分是文石, 這是由于隨著生長期的增加,碳酸鈣不斷沉積, 殼體增厚, 不斷形成新的文石, 從而使扇貝在生長過程中通過殼質超微結構調整不斷獲得個體生長所必需的性能。

3.2 殼色差異對殼外表面元素組成和含量的影響

貝殼的主要成分是碳酸鈣, 占其重量的 90%以上[23]。本試驗選取不同殼色的蝦夷扇貝, 初步分析了貝殼外表面的元素組成, 在分析比較的5種元素C、O、Na、Mg、Ca中, C、O、Ca 3種元素的含量占絕對優勢。Ca元素含量在 2種貝殼中表現出了差異,“象牙白”品系Ca元素的質量分數比普通紅褐色扇貝少了10.23%, Ca元素含量的減少可能會對殼質結構產生影響。研究表明雙殼類殼體中元素組成主要受殼體礦物物相類型的制約[24], 通常情況下, 文石質殼體內Mg元素含量較低, 為100～450 mg/kg, 而方解石質殼體內Mg元素含量則較高, 且范圍更廣[25]。因此, 研究殼質元素組成有利于進一步闡釋殼質結構。

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