Txt5腺病毒載體構建及其在心肌細胞中的表達

彭 浩，陳 宇，李佑鋒，朱 旋，周作瓊，吳秀山，范雄偉，李永青

(湖南師范大學 心臟發育研究中心 蛋白質化學及魚類發育生物學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410081)

Txt5位于2號染色體短臂11區2帶，長度為3239 bp，編碼蛋白含391個氨基酸，從N 端開始依次為LisH、CTLH、CRA 結構域.LisH 結構域被發現存在于很多病癥相關基因的產物之中[1-2].已經有研究證明，Txt5可能參與了MAPK 途徑對細胞生命活動的調控[3].RT-PCR 分析顯示這一基因在人類早期胚胎的多個組織中有表達，在心臟、肝和腎中表達水平較強.腺病毒轉染能夠使外源基因在原代細胞中高效表達[4]，為了進一步研究Txt5 基因的功能，本文利用Ad-Easy 腺病毒系統研制了小鼠Txt5 基因的過表達腺病毒[5]，為后續研究Txt5表達及生物學功能提供實驗依據.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 生物材料

解剖小鼠取心臟提取mRNA，反轉錄獲得cDNAs.連接載體pMD18-T 購買于Takara.穿梭載體pAdTrack-CMV、BJ5183 菌株以及HEK293 A 細胞均為實驗室所保存.

1.1.2 所用主要試劑

PmeΙ、Pac Ι 內切酶均購買于NEB公司，T4 DNA連接酶、Sal Ι和Hind III 限制性內切酶買于Takara公司;膠回收純化試劑盒購買于康維世紀公司，逆轉錄試劑盒購買于Thermo fisher公司，小量快速質粒提取試劑盒購買于康維世紀公司;兔源HA 一抗為美國圣克魯斯公司生產;Lipofectamine 2000 試劑購買于英濰捷基公司;高糖DMEM 培養基、F12 培養基和胎牛血清購買于Hyclone公司.

1.2 方法

1.2.1 穿梭質粒pAdTtrack-CMV-Txt5的構建

根據NCBI 數據庫，設計特異引物如下:5'-AGATCTATGGATCAGTGCGTGACGGTG-3'和5'-AAGCTTTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GAAAAATATCTGTTTGGCATCTCCT-3'.

PCR 擴增目標片段經測序正確后連接至pMD-18 T 載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，卡那霉素篩選陽性克隆.

1.2.2 pAd-Txt5的獲得

質粒小提試劑盒提取穿梭質粒pAdTrackCMV-Txt5，用Pme Ι 酶37℃酶切過夜線性化，純化回收酶切產物.將產物轉化進入BJ5183 感受態，通過其內的重組組件發生同源重組，涂布于卡那抗性平板上篩選.質粒小提試劑盒提取重組質粒，37℃Pac Ι 酶切過夜線性化，2%凝膠電泳觀察是否有兩條帶，利用酚氯仿法抽提DNA，保存于-20℃.

1.2.3 線性化pAd-Txt5 轉染HEK 293 A 細胞

復蘇凍存于液氮中的HEK 293A 細胞，培養于10 cm 培養皿中.當細胞融合率達80%左右后，取線性化的pAd-Txt5 4 μg，通過Lipofectamine 2000 轉染HEK 293 A 細胞.5 h 后換含10%胎牛血清的培養液10 ml，轉染12 h 后通過熒光顯微鏡觀察HEK 293 A 細胞綠色熒光情況，之后每隔12 或24 h 觀察熒光并拍照.在第10 d 左右，會有大團細胞漂浮.吸打下細胞，將細胞液用液氮反復凍融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分裝于-80℃保存.

1.2.4 Ad-Txt5 病毒顆粒的擴增

10 cm 皿中293 A 細胞密度約達80%的時候，開始轉染:取0.4 ml 病毒粗提液溶液加到皿中，在第3 d左右，會有大團細胞漂浮.將細胞吸打下來，將細胞液用液氮反復凍融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分裝于-80℃保存.

1.2.5 分離和培養原代心肌細胞

解剖出生一或兩天SD 大鼠，冰上剪取心臟的心室心尖，PBS 中洗去血液.接著剪碎組織，先后于0.06%胰酶中和II 型膠原酶中進行消化.然后將消化完全后的液體加入10 mL 含10% FBS 培養基中終止消化，混勻，2 000 r/min，10 min，倒去上清.加5 mL含10% FBS的培養基再洗一次，2 000 r/min，5 min.倒去上清，用20 mL 含10% FBS和0.067 mg/mL 濃度Brdu的DMEM-F12 培養液混勻細胞，200 目篩過濾細胞液至兩個10 cm 皿中.差速貼壁2 h 后，將懸浮細胞液體吸取到10 cm 皿中，2 d 后更換培養基.

1.2.6 免疫印跡鑒定

將Ad-Txt5 重組腺病毒和Ad-GFP 空載腺病毒感染心肌細胞，72 h 之后可見到綠色熒光，收取心肌細胞，提RNA 及蛋白.將蛋白進行電泳:配置電泳膠，加入等體積的蛋白樣品40 μg，120 V 電泳20 min;濕轉:100 V，90 min 將蛋白轉到PVDF 膜上，15 V，1 h.加封閉液(TBST 加5%脫脂奶粉)，37℃封閉1～2 h;用TBST 洗去牛奶的顏色;兔源HA 一抗孵育，4℃過夜;TBST 溶液洗膜，3次，每次5 min，然后進行二抗的孵育，加入二抗，室溫1 h;TBST 溶液再次洗膜3次，每次10 min;加入ECL 系統顯色，壓片，洗膜，觀察結果.

1.2.7 RT-PCR

按mRNA Selective PCR Kit 試劑盒說明書取適量的RNA 進行逆轉錄.利用cDNA為模板，進行一般的PCR實驗，反應程序:95℃，預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環;72℃延伸8 min.4℃保存，通過凝膠電泳來分析PCR 結果.

RT-GAPDH-S:5'AGCCCAGAACATCATCCCT3'

RT-GAPDH-A:5'GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG3'

2 結果分析

2.1 pAd-Txt5 質粒的獲得與鑒定

將pMD18-T-Txt5 利用Sal Ι和Hind III 限制性內切酶進行雙酶切，純化回收目的片段連接于同樣雙酶切后的穿梭載體pAdtrack-CMV 上，接著進行轉化，提取出穿梭質粒pAdTrack-CMV-Txt5.再次Sal Ι和Hind III 限制性內切酶雙酶切穿梭質粒進行鑒定，1.8%瓊脂糖凝膠電泳結果有2條帶，上方條帶約為9 200 bp，下方條帶約為1 000 bp，證明穿梭質粒構建成功(圖1A).將重組完成后的腺病毒質粒用Pac Ι 酶切后進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳結果有2條帶，上方條帶約為34 kb，下方條帶約為4 kb 亮帶，說明腺病毒質粒pAd-Txt5 成功獲得(圖1B).

2.2 腺病毒顆粒的獲得

腺病毒質粒pAd-Txt5 線性化之后轉染HEK 293A細胞，24 h 后可見到綠色熒光(GFP)，之后熒光逐漸增多，48 h 時熒光大量出現(圖2)，12 d 左右，細胞大團飄起，移液器將細胞吸打下來，反復凍融獲得病毒溶液，過濾后再次感染293 A 細胞，12 h 后依然可以看到綠色熒光.

2.3 Txt5 過表達腺病毒在心肌細胞中的表達

圖1 穿梭質粒pAdTrack－CMV－Txt5和腺病毒質粒pAd－Txt5酶切后電泳圖

圖2 線性化pAd－Txt5轉染48 h后觀察結果(×20)

Txt5 基因通過IRES 序列與腺病毒載體基本骨架中的GFP 序列共表達，感染了腺病毒的心肌細胞就會出現綠色熒光.Txt5 過表達腺病毒感染SD 大鼠原代心肌細胞，48 h 后出現比較強的綠色熒光.病毒沒有使心肌細胞出現明顯的死亡現象且形態完整，可見毒性還算安全(圖4).

為檢測腺病毒是否能發揮應有的作用，將過濾后的病毒粗提液感染SD 大鼠原代心肌細胞.提取RNA和蛋白，然后進行RT-PCR，另外用兔HA 一抗和羊抗兔二抗做Western blot 檢測.RT-PCR 顯示，Txt5表達上調;Western blot的結果顯示，感染Txt5 過表達腺病毒的心肌細胞中檢測到與Txt5 融合表達的HA，而感染空載腺病毒Ad-GFP的對照組中未檢測到該條帶(圖4)，說明該腺病毒成功介導Txt5 在SD 大鼠原代心肌細胞中的表達.

圖3 Txt5過表達腺病毒感染原代心肌細胞觀察結果

圖4 RT－RCR與免疫印跡法檢測腺病毒效果

3 討論

研究發現許多神經系統疾病相關基因的產物都具有LisH 結構域[6].這一結構域可能參與調節微管的動力，參與二聚化或與微管胞質動力蛋白重鏈相結合.Txt5 蛋白包含有LisH 結構域，這給我們啟示，是否Txt5和MAPK 信號通路有關[7].MAPK是一類重要的細胞信號轉導激酶，調節多種激素、神經遞質、細胞因子、生長因子對細胞生理活動的作用，該激酶作用底物多為例如Elk21、AP21[8]等的轉錄因子.

腺病毒在研究基因功能和治療方面的應用具有以下優勢:1)比較廣的宿主范圍，可以感染原代心肌細胞;2)能有效進行增殖，滴度較高，易于培養;3)基本上不插入宿主的基因組，不造突變[9-10].本文所用的腺病毒載體基本骨架中便含有GFP 序列，通過IRES 序列Txt5 基因與GFP 共表達，綠色熒光就會出現在感染了腺病毒的心肌細胞，視覺上就能判定感染效率.而RT-PCR 證明mTxt5 水平的上調，western blot發現HA表達，說明腺病毒效果良好，符合實驗要求.

本文研制小鼠Txt5 過表達腺病毒的操作簡單，周期較短，并且獲得的腺病毒滴度較高，毒性不強，能滿足體外實驗的要求.而現今市面上檢測Txt5的抗體比較少，本文研究設計中將Txt5 與HA 標簽融合表達，從而可以通過常用的HA 對應抗體檢測Txt5表達，給Txt5表達水平和位置的研究帶來了極大的幫助.

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