不同抽吸模式下煙氣冷凝物對人口腔細胞體外生長增殖的影響

范子彥，翟 妞，李中皓，楊 飛，劉珊珊，張洪非，邊照陽，唐綱嶺*

1.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2.國家煙草基因研究中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

不同抽吸模式下煙氣冷凝物對人口腔細胞體外生長增殖的影響

范子彥1，翟 妞2，李中皓1，楊 飛1，劉珊珊1，張洪非1，邊照陽1，唐綱嶺*1

1.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2.國家煙草基因研究中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

為考察卷煙煙氣暴露對人口腔細胞體外生長增殖的影響，以肯塔基參比卷煙3R4F為試驗卷煙，人口腔表皮樣癌細胞為實驗模型，分別在ISO和加拿大深度抽吸（HCI）模式下制備煙氣冷凝物并對細胞進行染毒暴露，評估了兩種抽吸模式下煙氣暴露對人口腔細胞代謝活性及核酸復制活性的影響，并結合主流煙氣總粒相物（TPM）中主要有害成分的釋放水平進行了分析。結果表明：①煙氣冷凝物暴露對人口腔細胞體外增殖有抑制作用，對人口腔細胞代謝活性以及核酸的復制活性有一定的毒性作用。②HCI抽吸模式下3R4F卷煙單位TPM和單位煙堿中有害成分的釋放量低于ISO模式，HCI抽吸模式下制備的煙氣冷凝物含水率高于ISO模式，這兩種因素是導致3R4F卷煙HCI模式下煙氣冷凝物細胞毒性弱于ISO模式的主要原因。

人口腔細胞;煙氣冷凝物;細胞增殖毒性;抽吸模式;3R4F

流行病學研究表明口腔疾病的發生與吸煙有一定的相關性，發病過程涉及基因損傷、蛋白異常表達、氧化應激、炎癥反應等多個生物效應的參與，但具體的致病機制尚未闡明［1-3］。為了闡明致病機制，基于煙氣冷凝物的體外毒理學實驗方法已被建立并廣泛應用于卷煙煙氣介導的口腔毒理學研究。目前的煙氣冷凝物的制備主要是在國際標準 ISO 4387：2000［4］中所規定的吸煙機參數條件下進行。隨著全球控煙運動的不斷高漲，特別是在《煙草控制框架公約》［5］正式生效以來，以世界衛生組織為代表的控煙機構對ISO抽吸模式提出了質疑，認為ISO抽吸模式下卷煙煙氣釋放量不能真實反映人體實際攝取量，并推薦了加拿大深度抽吸（HCI）模式［6］。據文獻報道，在這兩種卷煙抽吸模式下，卷煙主流煙氣中的焦油、煙堿、煙草特有亞硝胺等的釋放量存在差異［7-9］，這在一定程度上表明不同抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對口腔細胞的毒性存在潛在差異。另一方面，開展常規的煙氣毒理學測試研究是使用動物細胞模型，比如中國倉鼠卵巢細胞CHO等，獲得的實驗結果能否外推至人體還存在一定的爭議［10-12］。因此，在ISO和HCI抽吸模式下分別制備卷煙主流煙氣冷凝物，采用不同暴露濃度（質量濃度）對人體口腔細胞進行體外染毒暴露，評估不同抽吸模式對人口腔細胞體外生長增殖的毒性作用，旨在為吸煙與口腔疾病的關系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

肯塔基參比卷煙3R4F（美國肯塔基大學）；人口腔表皮樣癌KB細胞（中國科學院上海生科院細胞資源中心）。α-MEM培養基、滅菌PBS（美國Gibco公司）；胎牛血清（北京四季青公司）；胰酶、二甲基亞砜（生物純，DMSO，美國Amresco公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍，MTT）染色試劑（美國Introvigen公司）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）摻入實驗試劑盒（美國Roche公司）。

CP2245電子分析天平（感量：0.000 1 g，德國Satorious公司）；Thermo Scientific Series 8000型CO2細胞培養箱、Forma 900超低溫冰箱、超凈工作臺（美國Thermo公司）；細胞培養瓶、96微孔板（美國Corning Costar公司）；DMI 4000B倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Spextra Max M5酶標儀（美國Molecular Devices公司）；RM20H轉盤型吸煙機（德國Borgwaldt KC公司）；空氣浴搖床（上海智城公司）；Milli-Q超純水純化系統（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗方案的設計

將卷煙樣品于（22±1）℃和相對濕度（60±3）%條件下平衡48 h。用RM20H轉盤型吸煙機在ISO和HCI兩種抽吸模式下分別抽吸卷煙并制備煙氣冷凝物。設計不同的煙氣冷凝物濃度對口腔細胞進行24 h染毒實驗，用MTT和BrdU核酸摻入試驗分別對細胞中線粒體的代謝活性和核酸復制活性進行考察，評估煙氣冷凝物對人口腔細胞體外生長增殖的影響，實驗方案如圖1所示。

1.2.2 不同抽吸模式下煙氣冷凝物的制備

按照 GB/T 5606.1—2004［13］抽取卷煙樣品，并用RM20H轉盤型吸煙機在ISO和HCI兩種抽吸條件下分別抽吸，用92 mm劍橋濾片收集煙氣總粒相物TPM，根據TPM的質量加入相應體積的DMSO，制得最終濃度為10 mg/mL的TPM儲備液［14］。

1.2.3 細胞培養及處理

將人口腔表皮樣癌KB細胞置于含10%胎牛血清的a-MEM完全培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養。當細胞匯合率為70%～80%時，用胰酶消解，培養基重懸制成單細胞懸液，調節細胞濃度至4×104個/mL，按每孔100μL接種到96孔板，過夜培養。當傳代細胞至對數生長期時，棄去培養基，加入100μL不同濃度梯度的煙氣冷凝物對細胞進行染毒，同時根據不同濃度梯度煙氣冷凝物中DMSO的體積分數設計空白對照組。

1.2.4 MTT試驗

稱取0.5 g MTT，溶于100 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，用0.22μm水相濾膜過濾除去溶液中的細菌，制成5 mg/mL MTT溶液。細胞染毒24 h后，每孔加入20μL MTT溶液，在37℃、5%CO2條件下繼續培養4 h，棄去培養基。每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解，在490 nm波長下測量每孔吸光值。1.2.5 BrdU摻入試驗

圖1 實驗方案

細胞染毒24 h后，每孔添加BrdU標記溶液10 μL，在37 ℃、5%CO2條件下繼續培養2 h，棄去培養基。用甲醇/醋酸固定細胞10 min，再用甲酰胺處理細胞，使細胞內的核酸變性。用200μL PBS清洗細胞3次，每孔加入100μL辣根過氧化物酶標記的BrdU抗體。用PBS清洗細胞后，每孔加入100μL底物，在370 nm波長下測量每孔的吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同抽吸模式下煙氣冷凝物對人口腔細胞的增殖活性的影響

2.1.1 對細胞代謝活性的影響

煙氣毒理學評估中常用的細胞有中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞），小鼠肺泡巨噬細胞（AM細胞）等［15］，由于將動物細胞研究結果外推至人體存在一定的爭議，因而人支氣管上皮細胞（BEP2D細胞）被引入煙氣毒理學測試［16］。但人支氣管上皮細胞是肺部細胞，在功能上與口腔細胞存在一定的差異。因此，在本研究中，以人口腔表皮樣癌KB細胞為模型細胞［17］，分別用ISO和HCI抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對人口腔細胞進行染毒，并使用MTT觀察煙氣冷凝物對細胞代謝活性的影響。MTT是一種熒光染料，它在活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的作用下，還原成水不溶的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，它能夠準確反映細胞中線粒體的代謝活性。MTT試驗結果（圖2）顯示，細胞用ISO和HCI模式下制備的煙氣冷凝物分別染毒后，甲瓚的熒光強度隨著煙氣冷凝物濃度的升高而逐漸降低，表明口腔細胞內線粒體的代謝活性受到了抑制，不能將MTT染料還原成甲瓚。對比圖2中人口腔細胞的代謝活性抑制曲線還可以發現，ISO模式下細胞的代謝活性降低速率大于HCI模式。采用t檢驗對圖2中ISO和HCI模式下各暴露濃度點進行統計學分析，結果表明，空白實驗以及40和300 mg/L煙氣冷凝物暴露濃度下，兩種抽吸模式下的MTT試驗結果沒有顯著性差異，其他暴露濃度下均存在顯著性差異。以80和160 mg/L為例，p值分別為0.002和0.03，其他系列濃度下的p值也均小于0.05。可見，在單位TPM濃度下，ISO模式的口腔細胞代謝毒性要大于HCI模式。

圖2 煙氣冷凝物對口腔細胞代謝活性的影響（n=3）

2.1.2 對核酸復制活性的影響

傳統的遺傳毒性評估主要是采用細菌回復突變試驗、小鼠微核試驗、人細胞程序外DNA合成試驗等，前兩種方法中分別使用細菌和動物細胞模型進行評估，人細胞程序外DNA合成試驗則直接反映外源物刺激對人細胞核酸復制的影響［18］。因此，為了直接評估煙氣冷凝物對人口腔細胞核酸復制的影響，同時為后續的口腔細胞轉錄組實驗尋找合適的暴露濃度［19］，采用BrdU核酸摻入試驗考察了煙氣冷凝物的口腔細胞遺傳毒性。BrdU是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶和檢測細胞內核酸的BrdU摻入情況，可以直接評估細胞內的核酸復制活性，也能間接反映煙氣冷凝物對人口腔細胞的遺傳毒性。從圖3中可以看出，與MTT試驗結果類似，ISO抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對人口腔細胞核酸復制活性的抑制作用要大于HCI模式，表明ISO模式下的煙氣冷凝物對人口腔細胞有較高的潛在遺傳毒性。對圖3中各暴露濃度點進行統計學分析，結果表明，在空白實驗和最大暴露濃度下，兩種抽吸模式煙氣冷凝物的BrdU試驗結果沒有顯著性差異，其他暴露濃度下均存在顯著性差異。以80和160 mg/L為例，p值分別是0.004和0.02，其他系列濃度下的p值也均小于0.05。

圖3 煙氣冷凝物對口腔細胞核酸復制活性的影響（n=3）

2.1.3DMSO對MTT和BrdU試驗的影響

在煙氣冷凝物制備過程中，以DMSO為TPM的萃取溶劑。為了評估DMSO在整個實驗過程中的毒理效應貢獻，根據煙氣冷凝物的用量，計算出細胞染毒時DMSO的量，并對細胞進行單獨的DMSO暴露。結果（圖4）顯示，當DMSO的體積分數低于2%時，不會對人口腔細胞產生強毒性作用。可見，MTT和BrdU試驗中細胞毒性主要是由煙氣冷凝物暴露所致。

圖4 DMSO暴露對口腔細胞毒性的影響（n=3）

2.2 不同抽吸模式下煙氣中有害成分釋放量的差異分析

煙氣冷凝物的細胞毒性主要由煙氣中的有害成分導致，據文獻［8,20-21］報道，不同抽吸模式下，煙氣中有害成分的釋放量存在差異，這些差異可能是對口腔細胞的毒性造成差異的原因。因此，對肯塔基參比卷煙3R4F煙氣中主要有害成分的釋放量進行了定量分析，得到了單位TPM和單位煙堿有害成分釋放量（表1）。將表1中幾種有害成分的單位TPM和煙堿釋放量進行歸一化處理，得到兩種抽吸模式下3R4F煙氣中粒相物主要有害成分的釋放量比值（圖5）。由圖5可知，幾種有害成分的HCI/ISO比值均小于1，說明盡管HCI模式下每支卷煙煙氣粒相物中主要有害成分的釋放量大于ISO模式，但是單位TPM或單位煙堿有害成分釋放量則相反，從而導致MTT和BrdU試驗中HCI模式下煙氣冷凝物的細胞毒性弱于ISO模式。

表1 3R4F煙氣粒相物中主要有害成分釋放量①

圖5 兩種抽吸模式下3R4F煙氣中粒相物主要有害成分的釋放量比值（HCI/ISO）

2.3 不同抽吸模式下煙氣含水率差異分析

采用CORESTA推薦的方法檢測了兩種抽吸模式下3R4F卷煙主流煙氣水分，其中ISO模式下煙氣水分為134μg/mg TPM，而HCI模式下的煙氣水分為425μg/mg TPM，表明在HCI抽吸模式下，煙氣含水率大幅升高，稀釋了煙氣中的有害成分。另一方面，煙氣中單位煙堿有害成分釋放量扣除了水分的影響。圖5表明，在HCI模式下，單位煙堿有害成分釋放量較ISO模式下也有所降低，這可能是因為HCI模式下卷煙得到了充分燃燒所致。可見，對于肯塔基參比卷煙3R4F，HCI模式下煙氣冷凝物的細胞毒性低于ISO模式是由水分釋放量增加以及單位TPM、單位煙堿有害成分釋放量降低共同導致。

3 結論與討論

以3R4F為試驗卷煙，分別在ISO和HCI抽吸模式下制備煙氣冷凝物，以人口腔表皮樣癌細胞為實驗模型，使用煙氣冷凝物對細胞進行染毒暴露，評估了不同抽吸模式下煙氣冷凝物對人口腔細胞體外生長增殖的毒性作用。煙氣冷凝物暴露對人口腔細胞體外生長增殖具有抑制作用，對人口腔細胞的線粒體的代謝活性以及核酸的復制活性具有一定的毒性作用。煙氣冷凝物對細胞代謝活性和核酸復制活性的影響可能會導致細胞內疾病相關基因的差異表達，而相關的調控通路上關鍵蛋白因子受基因調控也會差異表達，并最終產生一定的生理效應，這將為后續的基因和蛋白水平的研究提供線索。

對主流煙氣粒相物有害成分釋放水平的進一步研究表明，HCI模式下3R4F卷煙單位TPM和單位煙堿有害成分釋放量低于ISO模式，這與Roemer等［22］的研究結果相一致。另一方面，HCI抽吸模式制備的煙氣冷凝物含水率高于ISO模式。因此，上述兩個因素是導致3R4F卷煙煙氣冷凝物HCI模式下煙氣冷凝物細胞毒性弱于ISO模式的主要原因。值得注意的是，在HCI模式下，單支卷煙的有害成分釋放量大于ISO模式，對生物體存在較高的安全風險。然而，目前的體外毒理學評價是基于單位TPM的方式，這不能有效反映單支卷煙不同抽吸模式下有害成分釋放物對生物體的影響，因此，為了更有效、真實地反映煙氣暴露的生物效應，基于卷煙全煙氣暴露的煙氣毒理學評估方法今后將得到更多的關注。

［1］ Rodriguez T，Altieri A，Chatenoud L，et al.Risk factors for oral and pharyngeal cancer in young adults［J］.Oral Oncology，2004，40（2）：207-213.

［2］ Jorgensen E D，Dozmorov I，Frank M B，et al.Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells treated with tobacco condensates［J］.Cell Cycle，2004，3（9）：1152-1166.

［3］ Fields W R，Leonard R M，Odom P S，et al.Gene expression in normal human bronchial epithelial（NHBE）cells following in vitro exposure to cigarette smoke condensate［J］.Toxicology Science，2005，86（1）：84-91.

［4］ ISO 4387：2000 Cigarettes—Determination of total and nicotine free dry particulate matter using a routine analytical smoking machine［S］.

［5］ World Health Organization. WHO Framework Convention on Tobacco Control［R/OL］.［2014-10-24］.http：//www.who.int/fctc/text_download/en/.

［6］ Hammond D，Wiebel F，Kozlowski L T，et al.Revising the machine smoking regime for cigarette emissions：implicationsfortobacco controlpolicy［J］.Tobacco Control，2007，16（1）：8-14.

［7］ Moir D，Rickert W S，Levasseur G，et al.A comparison of mainstream and sidestream marijuana and tobacco cigarette smoke produced under two machine smoking conditions［J］.Chemical Research Toxicology，2007，21（2）：494-502.

［8］ Hammond D，O’Connor R.Constituents in tobacco and smoke emissions from Canadian cigarettes［J］.Tobacco Control，2008，17（Suppl 1）：i24-i31.

［9］ 李中皓，唐綱嶺，張洪非，等.兩種抽吸模式下卷煙主流煙氣中主要酚類的釋放量比較［J］.煙草科技，2010（10）：27-33.

［10］李翔，聶聰，尚平平，等.采用全煙氣暴露系統測試卷煙主流煙氣細胞毒性［J］.煙草科技，2012（5）：44-47.

［11］盧斌斌，周駿，朱忠.不同焦油釋放量卷煙煙氣的細胞毒性和基因毒性研究［J］.中國煙草學報，2010，16（增刊）：66-69.

［12］Putnam K，Bombick D，Doolittle D.Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate［J］.Toxicology in Vitro，2002，16（5）：599-607.

［13］GB/T 5606.1—2004 卷煙第1部分：抽樣［S］.

［14］Health Canada Official Method T-501：2004 Bacterial reverse mutation assay for mainstream tobacco smoke［S］.

［15］Agarwal A，Saleh R A，Bedaiwy M A.Role of reactive oxygen species in the pathophysiology ofhuman reproduction［J］.Fertility and Sterility，2003，79（4）：829-843.

［16］Binderup M L，Pedersen G A，Vinggaard A，et al.Toxicity testing and chemicalanalysesofrecycled fibre-based paper for food contact［J］.Food Additives&Contaminants 2002，19（S1）：13-28.

［17］Chang K W，Chang C S，Chou M J，et al.High prevalence of human papillomavirus infection and possible association with betelquid chewing and smoking in oral epidermoid carcinomas in Taiwan［J］.Journal of Medical Virology 1989，28（1）：57-61.

［18］Serrano G L，Montero M R.Micronuclei and chromatid buds are the result of related genotoxic events［J］.Environmental and Molecular Mutagenesis 2001，38（1）：38-45.

［19］Schembri F，Sridhar S，Perdomo C，et al.MicroRNAs as modulators of smoking-induced gene expression changes in human airway epithelium［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences 2009，106（7）：2319-2324.

［20］Burns D，Dybing E，Gray N，et al.Mandated lowering of toxicants in cigarette smoke：a description of the World Health Organization TobReg proposal［J］.Tobacco Control，2008，17（2）：132-141.

［21］Wu J，Joza P，Sharifi M，et al.Quantitative method for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in cigarette tobacco and mainstream cigarette smoke by use of isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Analytical Chemistry，2008，80（4）：1341-1345.

［22］RoemerE，Carchman R.Limitations of cigarette machine smoking regimens［J］.Toxicology Letter，2011，203（1）：20-27.

Effects of Cigarette Smoke Condensate Collected Under Different Smoking Regimes on in vitro Proliferation of Human Oral Cell

FAN Ziyan1,ZHAI Niu2,LI Zhonghao1,YANG Fei1,LIU Shanshan1,ZHANG Hongfei1,BIAN Zhaoyang1,and TANG Gangling*1
1.China National Tobacco Quality Supervision and Test Center,Zhengzhou 450001,China
2.China National Tobacco Gene Research Center,Zhengzhou 450001,China

In order to investigate the effects of exposure to cigarette smoke on the in vitro proliferation of human oral cell,Kentucky 3R4F reference cigarette was used as experimental cigarette and human oral epidermoid carcinoma cell line KB as experimental model.Cigarette smoke condensates(CSCs)were collected under ISO and Health Canada Intense(HCI)smoking regimes for the exposure assessment of human oral cells,the effects of CSCs on the metabolic activity and nucleic acid replication activity of the cells were assessed,and further analyzed versus the release levels of main harmful components in total particulate matter(TPM)of mainstream cigarette smoke.The results indicated that:1）CSCs exposure inhibited the in vitro proliferation of oral cells and imparted certain toxicity to their metabolic activity andnucleic acid replication activity.2）Under HCI smoking regime,the release of harmful components per unit TPM and per unit nicotine in mainstream smoke of 3R4F reference cigarette was lower and the moisture content in CSCs was higher than those under ISO regime;these two factors explained the lower cytotoxicity of HCI regime CSCs.

Human oral cell;Cigarette smoke condensate;Cell proliferation toxicity;Smoking regime;3R4F

TS416

A

1002-0861（2015）12-0048-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151208

2014-12-24

2015-08-12

中國煙草總公司科技重點項目“國內外卷煙主要有害成分釋放量中位值及其影響因素研究”（562014AA0020）；中國煙草總公司鄭州煙草研究院院長基金項目“煙氣暴露介導的口腔原代細胞miRNA表達譜及其靶基因的篩選與鑒定”（512013CA0120）。

范子彥（1983—），博士，工程師，主要從事煙草化學檢驗和煙氣毒理學研究。E-mail:fanzy@ztri.com.cn；*

唐綱嶺，E-mail:tglcttc@163.com

范子彥，翟妞，李中皓，等.不同抽吸模式下煙氣冷凝物對人口腔細胞體外生長增殖的影響［J］.煙草科技，2015，48（12）：48-53.FAN Ziyan,ZHAI Niu,LI Zhonghao,et al.Effects of cigarette smoke condensate collected under different smoking regimes on in vitro proliferation of human oral cell［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：48-53.

責任編輯 洪廣峰