大鼠線粒體膜蛋白Nix基因過表達與shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定＊

張君莉，黃永秀，張 紅，王 丹，劉 騰，李 亞△，王建東△

1.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系（成都 610500）；2.成都醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院（成都 610500）；3.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科（成都 610500）

線粒體是細胞能量供應的重要細胞器，能通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化進行能量轉(zhuǎn)換［1］。線粒體健康與否決定了細胞的生存和死亡［2－4］。大量證據(jù)顯示，許多疾病都有一個共同的特征：功能障礙的線粒體大量堆積，包括心臟疾病［5］、阿爾茲海默癥［6］、帕金森疾?。?］、腫瘤［8］和糖尿病等［9］。Nix是近年來發(fā)現(xiàn)定位于線粒體外膜的一類功能蛋白，在調(diào)節(jié)細胞自噬和線粒體自噬的過程中發(fā)揮著重要作用［10－11］。本研究旨在構(gòu)建Nix基因過表達與shRNA慢病毒載體，為進一步深入探索Nix參與細胞自噬的分子機制奠定更好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。pcDNA3.1（＋）－N2－FLAG－Nix質(zhì)粒由四川大學華西第二醫(yī)院姜長安教授惠贈。DMEM完全培養(yǎng)基購自HyClone公司。胎牛血清購自以色列BioInd公司。BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物科技研究所?？贵wanti－Nix購自Cell Signaling Technology 公 司。anti－β－actin 購 自Novus Biologicals公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔或鼠二抗購自CST公司。羊抗兔Alexa Fluor 488購自碧云天公司。PVDF膜和ECL化學發(fā)光試劑購自Millipore公司。嘌呤酶素（puromycin）購自北京索萊寶科技有限公司。Nix過表達、Nix shRNA慢病毒和對照慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Nix慢病毒表達載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank提供的大鼠Nix基因全長信息，設計PCR擴增引物，以pcDNA3.1（＋）－N2－FLAG－Nix質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。Nix基因序列信息：AT GTCTCACTTAGTCGAGCCGCCGCCGCCCCTGC ACAACAACAACAACAACTGCGAGGAAG G G G AGCAGTCCCTGCCGCCGCCCGCTGGCCTCAAC AGTTCCTGGGTGGAGCTACCCATGAAC A GCA GCAATGGCAACGGTAATGGAAATGGGAAGA ATGGGGGCCTGGAGCACGTTCCTTCCTCGT C TTCCATCCACAATGGAGACATGGAGAA G AT CCTTCTGGATGCGCAGCATGAGTCG G G A C A GAGCAGCTCAAGAGGCAGTTCTCACT G T G A CAGCCCTTCACCACAAGAAGACGGGC A A A T AATGTTTGATGTTGAGATGCACACCA G C AG GGACCACAGCTCTCAGTCAGAAGAAGA A G T TGTAGATGGAGAAAAAGAAGTTGAG G C T T TGAAGAAAAGTGCAGACTGGGTATCAGACT GGTCCAGTAGACCCGAAAACATCCCACCCAA AGAGTTCCATTTCAGACACCCTAAG C G T G C AGCCTCTCTAAGCATGAGGAAGAGTGGA G C CATGAAGAAAGGGGGCATTTTCTCTGCA G A GTTCCTGAAGGTCTTCATCCCATCTCTCT T C CTCTCTCACGTGTTGGCTTTGGGGCTGGGCA TCTATATCGGAAAACGACTGAGCAC A C C TT CTGCCAGCACCTACTGA。將處理好的目的片段連接到經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的慢病毒pHBLV－CMVIE－IRES－Puro載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，Nix平板篩選陽性重組子并進行測序鑒定。靶序列設計與合成均由上海漢恒生物科技有限公司完成。

1.2.2 Nix shRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建 分別根據(jù)Genbank中大鼠Nix基因序列，設計與合成3對shRNA靶序列。其中，正義鏈5′端引入BamHⅠ酶切位點，反義鏈5′端引入EcoRⅠ酶切位點。Nix siRNA1序列：正義鏈5′－GATCCGGAAGAG TGGAGCCATGAAGATTCAAGAGATCTTCAT GGCTCCACTCTTCCTTTTTC－3′，反義鏈 5′－AA TTGAAAAAAGGAAGAGTGGAGCCATGAAG ATCTCTTGAATCTTCATGGCTCCACTCTTCCG－3′；Nix shRNA2 序 列：正 義 鏈 5′－GATCCGCACCAGCAGATTATAATCTTGTCAATTCAA GAGATTGACAAGATTATAATCTGCTGGTGTTTTTTC－3′，反 義 鏈5′－AATTGAAAAAACACCAGCAGATTATAATCTTGTCAATCTCTTGAATTGACAAGATTATAATCTGCTGGTGCG－3′；Nix shRNA3序列：正義鏈5′－GATCCGCACTCTG AGGGAATCTGTGTCTTATTTCAAGAGAATA AGACACAGATTCCCTCAGAGTGTTTTTTC－3′，反 義 鏈5′－AATTGAAAAAACACTCTGAGGGA ATCTGTGTCTTATTCTCTTGAAATAAGACA CAGATTCCCTCAGAGTGCG－3′（下劃線處為干擾序列）。將合成的DNA單鏈退火形成雙鏈，連接到經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的慢病毒pHBLVU6－Scramble－Puro載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 DH5α，Nix shRNA平板篩選陽性重組子并進行測序鑒定。靶序列設計與合成均由上海漢恒生物科技有限公司完成。

1.2.3 Nix和Nix shRNA慢病毒的包裝與滴度測定 取對數(shù)生長期的293T細胞，接種于75cm2細胞培養(yǎng)瓶中，接種量8×106個/孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞密度達80%～90%時，按照漢恒生物LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將含有重組子的慢病毒載體與病毒包裝輔助質(zhì)粒共感染293T細胞。轉(zhuǎn)染48和72h后分別兩次收集病毒上清，以0.45μm濾器過濾后，于40mL超速離心管中，4℃、離心120min（離心半徑20cm，轉(zhuǎn)速7 000r/min），500μL新鮮培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，置于－80℃保存。分別取部分慢病毒濃縮液，采用梯度稀釋法測定，并按照滴度（TU/mL）＝細胞數(shù)百分比×MOI（1）×病毒稀釋倍數(shù)×103，計算病毒滴度。慢病毒的包裝與滴度測定均由上海漢恒生物科技有限公司完成。

1.2.4 慢病毒感染PC12細胞和穩(wěn)定感染PC12細胞株的篩選 取對數(shù)生長期的PC12細胞，接種于24孔板中，接種量5×104個/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，待細胞密度達80%～90%時，以病毒液與培養(yǎng)液體積比1∶9的比例，加入對照慢病毒、Nix和Nix shRNA慢病毒進行感染，24h后更換新鮮培養(yǎng)液，48h后加入2.5μg/mL的puromycin篩選陽性細胞。持續(xù)篩選兩周后，獲得各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞株。

1.2.5 細胞熒光技術(shù)檢測Nix熒光數(shù)量 取對數(shù)生長期的對照慢病毒、Nix和Nix shRNA慢病毒穩(wěn)定感染的PC12細胞，接種于多聚賴氨酸包被圓玻片的24孔板中，接種量為5×104個/孔，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，冰甲醇－20℃，固定15min，PBS洗滌3次，加入封閉液室溫封閉1h，吸出封閉液，加入一抗（Nix 1∶200）后，4℃過夜。吸出一抗，PBS洗滌3次，加入二抗（羊抗兔Alexa Fluor 488 1∶500）37℃孵育1h，吸出二抗，PBS洗滌3次，封片，利用熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.6 Western blot檢測各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix蛋白的表達 分別收集對照慢病毒、Nix和Nix shRNA慢病毒穩(wěn)定感染的PC12細胞，加入ripa裂解液冰上裂解30min，于4℃、離心15min（離心半徑20cm，轉(zhuǎn)速1 2000r/min），收集裂解上清液，BCA法測定蛋白濃度。SDS－PAGE電泳，每組上樣60μg/泳道，PVDF膜濕轉(zhuǎn)60～80 min，一抗（Nix 1∶800、β－actin 1∶5 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（HRP標記的羊抗兔或鼠二抗1∶5 000）37℃孵育1h，TBST洗膜3次，凝膠成像法檢測相關(guān)蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體的測序鑒定

測序結(jié)果顯示，Nix過表達載體測序結(jié)果與設計的Nix靶序列完全一致。3條Nix shRNA慢病毒載體序列與設計的3對shRNA靶序列完全一致（圖1），表明成功構(gòu)建針對Nix基因的重組慢病毒載體。

2.2 病毒滴度測定

計算得到各組慢病毒滴度均達到2×108PFU/mL，滴度較高，可以用于下一步實驗要求。

2.3 細胞熒光技術(shù)檢測各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix熒光水平

熒光顯微鏡觀察各組慢病毒穩(wěn)定感染的PC12細胞，顯示Nix穩(wěn)定感染PC12細胞與對照細胞相比，Nix熒光水平明顯增強，Nix shRNA1穩(wěn)定感染PC12細胞與對照細胞相比，熒光水平明顯減弱（圖2）。

2.4 Western blot檢測各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix蛋白的表達情況

對各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix蛋白的表達情況分別進行Western blot檢測，可以看到Nix基因過表達感染PC12細胞中Nix蛋白表達顯著升高（圖3）。shRNA1、shRNA2和shRNA3慢病毒感染的PC12細胞中Nix蛋白表達明顯降低，其中shRNA1感染PC12細胞中Nix蛋白降低最顯著（圖4）。

圖1 慢病毒載體的測序結(jié)果

圖2 熒光顯微鏡觀察各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix熒光水平（×200）

圖3 Western blot檢測Nix基因過表達慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix蛋白的表達情況

圖4 Western blot檢測Nix shRNA各組慢病毒穩(wěn)定感染PC12細胞中Nix蛋白的表達情況

3 討論

線粒體自噬是細胞生物學研究的熱點，線粒體自噬功能障礙與多種疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，比如神經(jīng)退行性疾病、血液病、心血管疾病、代謝性疾病和腫瘤等［12］。深入研究線粒體自噬調(diào)控的分子機制將有利于更深入了解疾病的發(fā)病機制，為疾病的預防和治療提供新的靶點。

Nix是近年來發(fā)現(xiàn)的隸屬BCL－2家族中的BH3－only促凋亡家族成員，定位于線粒體，雖然具有BCL－2家族特征性的BH3域和羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域（TM），也能與BCL－2形成二聚體，但Nix促凋亡活動明顯不同于其他BCL－2家族成員［13］。研究［13］發(fā)現(xiàn)，Nix可以通過一種微弱或推遲的方式引起細胞死亡，并能誘導自噬，調(diào)節(jié)線粒體的清除。這些不同活動都涉及一個統(tǒng)一的主題，即線粒體。線粒體是Nix誘導自噬的重要中介，Nix通過不同機制使線粒體功能障礙，促進死亡因子釋放，最終細胞在發(fā)展過程中或壓力應激下通過Nix針對性清除線粒體。越來越多的證據(jù)顯示，Nix參與了人類疾病的發(fā)展［14－15］。在缺血性損傷和心臟疾病中，Nix表達水平降低，Nix缺失可保護由Gaq介導的壓力負荷型心臟病［16］。Nix在癌癥中的作用更為復雜［10］，在癌癥發(fā)展的不同時期，它既能促進細胞死亡又能促進細胞存活。在神經(jīng)退行性疾?。?7］如帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默癥中，Nix表達水平明顯升高。Nix表達的失調(diào)很大程度上影響了疾病的進展。在未來的研究中，我們將進一步闡明依賴Nix的細胞死亡機制，并確定其在疾病中的作用。

本研究采用酶切連接的方法，成功構(gòu)建了有關(guān)Nix基因過表達和shRNA慢病毒表達載體，并獲得Nix過表達與干擾細胞模型，為進一步研究Nix介導細胞自噬及線粒體自噬的分子機制奠定了基礎。

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