5-羥色胺5-HT2C受體激動劑抑制嗎啡依賴小鼠納洛酮誘導的戒斷行為

吳 縣，江 勤，龐 剛，劉 歡，3，陶欣榮，4，董六一，章功良

(安徽醫科大學1.藥理學教研室、2.藥物成癮研究所、3.精神衛生臨床學院，安徽合肥 230032;4.安徽理工大學，安徽淮南 232001)

阿片類藥物嗎啡及其化學合成衍生物海洛因的濫用、依賴和成癮已成為我國以及許多其他國家特別是西南亞、中亞、東南歐和北美洲等地區日益嚴重的社會問題。中國的吸毒人群以濫用海洛因等阿片類毒品為主，截至2013年底，全國累計登記吸毒人員247.5萬名，其中濫用阿片類毒品人員135.8萬名、濫用合成毒品人員108.4萬名，分別占54.9%和43.8%(2014年中國禁毒報告，國家禁毒委員會辦公室、公安部禁毒局)。阿片類毒品成癮嚴重損害了患者的身心健康、增加家庭和社會負擔和誘發了各種違法犯罪活動。

中樞神經系統5-羥色胺(5-HT)調節行為、情緒和認知等多種功能活動。5-HT通過對中腦-邊緣多巴胺系統的調節和與其受體相互作用影響大腦情感認知和成癮行為功能［1］。目前關于5-HT遞質系統在成癮中的研究集中于5-HT2受體家族，5-HT2受體家族包括5-HT2AR、5-HT2BR 和 5-HT2CR［2］。國內外大量研究發現5-HT2CR與藥物成癮性密切相關，其受體激動劑可以減弱成癮動物對可卡因、尼古丁和致幻劑的渴求、攝取以及復吸行為［3］。然而，目前5-HT2CR在嗎啡依賴和戒斷中的作用未見報道，在本實驗中，我們建立嗎啡依賴小鼠動物模型，研究5-HT2CR激動劑對嗎啡依賴小鼠戒斷行為的影響，初步探討5-HT2CR在嗎啡依賴防治中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 嗎啡:沈陽第一制藥廠，批號:080301;WAY:上海醫藥科技有限公司，批號:20140112;納洛酮:康哲(湖南)制藥有限公司，批號:20120209;鹽酸可樂定片:江蘇云陽集團藥業有限公司，批號:20130419。

1.1.2 實驗動物 SPF級昆明種小鼠80只，♀♂各半，體質量18～22 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，生產許可證號:SCXK(皖)2011-002，實驗動物使用許可證號:SYXK(皖)2011-007。飼養室溫:(22±2)℃;濕度:40% ～70%;照明周期:12 h明/12 h暗。

1.1.3 實驗儀器 PhenoTyper system(Noldus Information Technology，Wageningen，TheNetherlands，XT5.1);電子天平:梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠自發活動記錄和分析 取昆明種小鼠40只，♀♂各半，購入后適應動物房環境1周后，隨機均分成4組:生理鹽水對照組，5-HT2CR激動劑3個劑量組(0.5、0.75、1.0 mg·kg－1)每組10 只。動物每天記錄體重，每天撫摸小鼠3～5 min以減少實驗者對動物的應激刺激。實驗前3 d，每天用針刺皮膚，模擬腹腔注射(i.p.)過程，腹腔注射生理鹽水1次，以減少動物的應激反應。實驗前不禁食不禁水，小鼠實驗測試前一天適應記錄環境，觀察和記錄小鼠60 min內在記錄環境中運動距離和速度。5-HT2CR激動劑WAY 3個劑量組(0.5、0.75、1.0 mg·kg－1)腹腔注射給藥1次，正常對照組小鼠給予等體積生理鹽水。給藥后立即放入曠野實驗盒內，記錄時間為60 min，記錄分析運動距離和速度。所有動物進行1個星期的藥物洗脫后，被用于下一次實驗。

1.2.2 嗎啡依賴小鼠模型的誘導 取昆明種小鼠30只，體質量18～22 g，♀♂各半，隨機分為生理鹽水對照組、納洛酮(5.0 mg·kg－1)給藥組、WAY(0.5 mg·kg－1)給藥組。參照 EL-Kadi法，采用后肢皮下注射劑量遞增法形成嗎啡依賴模型［4－5］，造模方法見(Tab 1)。末次給藥2.5 h后，生理鹽水對照組腹腔注射等體積生理鹽水，納洛酮給藥組腹腔注射(5.0 mg·kg－1)劑量，WAY組腹腔注射(0.5 mg·kg－1)劑量。給藥后放入觀測盒內，記錄各實驗組小鼠60 min內運動距離和速度，以及在30 min內出現打洞、跳躍、清理臉部、“濕狗”樣抖動、舔爪子、伸展、抓撓、清理皮毛、清理會陰、直立等癥狀發生總次數［6］。

Tab 1 Induction of morphine dependence

1.2.3 不同劑量的5-HT2CR激動劑WAY對嗎啡依賴小鼠戒斷行為的影響 取昆明種小鼠50只，體質量18～22 g，♀♂各半，隨機分為生理鹽水對照組，5-HT2CR 激動劑 (0.5、0.75、1.0 mg·kg－1)劑量組及可樂定(0.2 mg·kg－1)陽性對照組，每組10只。參照“1.2.2”誘導嗎啡依賴小鼠模型方法，末次給藥2.5 h后，生理鹽水對照組腹腔注射等體積生理鹽水，陽性對照組腹腔注射可樂定(clonidine，0.2 mg·kg－1)，給藥組各組分別一次腹腔注射(0.5，0.75或1.0 mg·kg－1)劑量的5-HT2CR 激動劑WAY。30 min后腹腔注射納洛酮(5.0 mg·kg－1)催癮，立即放入觀測盒內，記錄各實驗組小鼠60 min內運動距離和速度，以及在30 min內出現打洞、跳躍、清理臉部、“濕狗”樣抖動、舔爪子、伸展、抓撓、清理皮毛、清理會陰、直立等癥狀發生總次數。1.3 統計學分析 將實驗數據用SPSS 19.0(IBM)軟件處理系統分析數據，結果以±s表示，組間進行單因素方差分析，如果差別有顯著性，進一步進行post-hoc Bonferroni多重比較檢驗。

2 結果

2.1 5-HT2CR激動劑WAY對小鼠自發活動的影響 單因素方差分析結果顯示，小鼠腹腔注射生理鹽水，WAY(0.5、0.75 或 1.0 mg·kg－1)后運動距離(F3，34=0.12，n.s.)和運動速度(F3，34=0.12，n.s.)，差異沒有顯著性(P ＞0.05)，見 Fig 1。

Fig 1 WAY alone does not affect locomotor activity

2.2 小鼠嗎啡戒斷模型 小鼠注射嗎啡7 d，與生理鹽水對照組相比，納洛酮給藥組可明顯增加戒斷行為，包括打洞、跳躍、清理皮毛、站立、“濕狗”樣抖動、搖頭、舔爪子、抓撓、清理臉部、清理會陰和體重減少(P＜0.01，Tab 2)，提示小鼠成功建立了嗎啡依賴戒斷模型。5-HT2CR激動劑WAY(0.5 mg·kg－1，i.p.)可以明顯降低小鼠運動距離(Fig 2A)和速度(Fig 2B)，對依賴小鼠的行為敏感化具有一定的抑制作用(Fig 2)。

2.3 5-HT2CR激動劑 WAY對納洛酮催促嗎啡依賴小鼠戒斷行為的影響 與生理鹽水對照組比較，(0.5、0.75、1.0 mg·kg－1)劑量的 WAY 明顯減少小鼠的一些戒斷癥狀，包括打洞、跳躍、清理皮毛、站立、“濕狗”樣抖動、搖頭、清理臉部和抓撓(P＜0.05)。可樂定(0.2 mg·kg－1，i.p.)陽性對照藥可樂定也可明顯降低戒斷癥狀，包括打洞、跳躍、清理皮毛、站立、“濕狗”樣抖動、搖頭、清理臉部和抓撓(P ＜0.05，Tab 3)。

Fig 2 WAY alone reduces locomotor activity in mice received chronic morphine treatment

2.4 5-HT2CR激動劑WAY對納洛酮催促嗎啡依賴小鼠自發活動的影響 劑量遞增法使小鼠形成對嗎啡的依賴，用納洛酮催促，記錄運動距離和運動速度，記錄時間為60 min。與生理鹽水對照組相比，腹腔注射 WAY(0.5、0.75、1.0 mg·kg－1)劑量組和可樂定 (0.2 mg·kg－1)明顯降低運動距離(Fig 3A)和運動速度(Fig 3B)(P＜0.01)。

3 討論

Fig 3 WAY inhibits naloxone-precipitated locomotor activity in morphine-dependent mice

在本研究中，我們首次發現5-HT2CR激動劑WAY抑制嗎啡依賴小鼠納洛酮誘導的戒斷行為，提示5-HT2CR參與阿片類物質戒斷和成癮的發生過程。吸毒與戒毒一直是世界性的話題與難題，尋找安全有效、能迅速脫毒及長久戒斷的藥物是神經藥理學家追求的目標。阿片類物質引起的強大的精神獎賞效應和戒斷反應是其毒癮形成、維持、復發以及強迫性覓藥行為的基礎［7－8］。中腦邊緣系統多巴胺(DA)獎賞系統與嗎啡成癮的形成和強化密切相關，中腦腹側被蓋區(VTA)DA能神經元投射到伏膈核(NAc)，內側前額葉皮層(PFC)等腦區［9］。目前認為成癮物質增加VTA的DA神經元興奮性，導致NAc的DA水平增加是產生成癮行為的基礎。正常情況下，VTA的DA能神經元的活動受到γ-氨基丁酸(GABA)能神經元的緊張性抑制，而GABA能神經元上存在μ和5-HT2C受體，當嗎啡與μ受體激動劑結合后，可抑制GABA能神經元。減少GABA的釋放，取消對于DA能神經元的緊張性抑制，使釋放到NAc區的DA量增加，作用于D1受體從而完成阿片的獎賞效應［10］。與此相對應，5-HT2C受體可以增加VTA的GABA能神經元活動，抑制DA能神經元輸出，從而抑制藥物攝取行為。此外，阿片類物質還可通過NAc的相應阿片受體，增加DA釋放產生直接效應［11］。除DA外，去甲腎上腺素(NE)、5-HT和興奮性氨基酸遞質系統也參與嗎啡等阿片類物質成癮、依賴、耐受和戒斷等反應。

目前治療嗎啡成癮的主要手段為用阿片受體激動劑的替代藥物遞減療法以及非阿片類脫毒藥物，它們的主要作用是對戒斷癥狀進行對癥處理。利用麻醉劑實現意識剝奪，從而使成癮者能夠沒有痛苦地渡過戒斷期也是一種治療手段［12］，然而這些藥物和手段僅能對癥治療，暫時緩解NE和乙酰膽堿(ACh)能等神經遞質興奮導致戒斷癥狀。因此尋找一種能夠較好地解決心理依賴從而降低復吸率的療法，就成了當務之急。

神經系統5-HT2CR調控藥物攝取和成癮行為。5-HT2CR在腦內與成癮發生、發展有關的多個區域表達，如皮質、中腦邊緣系統和杏仁核等。藥物濫用會導致 NAc細胞外 DA水平升高。研究發現在VTA中直接注射5-HT2CR激動劑Ro 60-0175可劑量依賴性的降低NAc和額葉內的細胞外DA水平，阻斷可卡因的成癮作用［13］。選擇性5-HT2CR拮抗劑SB-242084則產生與Ro 60-0175相反的作用，它可以增強VTA細胞的興奮和NAc及額葉DA的釋放，提示5-HT2CR激動劑可以通過GABA神經元抑制DA釋放，抑制藥物成癮行為。此外，Ro 60-0175除對于減少可卡因自身給藥行為有明顯效果，也可減少對酒精和尼古丁引起的自我給藥行為［14］。

Tab 2Naroxone precipitates withdrawal in morphine-dependent mice(±s)

Tab 2Naroxone precipitates withdrawal in morphine-dependent mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs saline group

Group n Burrowing Jumping Body grooming Rearing “Wet dog”shakes Head shakes Saline 9 3.89 ±0.59 5.78 ±0.86 7.00 ±0.60 1.00 ±0.29 1.33 ±0.33 2.22 ±0.46 Naloxone 10 6.10 ±0.43＊＊ 22.70 ±1.36＊＊ 14.10 ±0.82＊＊ 4.50 ±0.43＊＊ 5.00 ±0.47＊＊ 8.20 ±0.74＊＊WAY 8 2.38 ±0.32 10.75 ±0.98* 6.00 ±0.46 2.50 ±0.42 2.50 ±0.33 5.00 ±0.71*Mice received morphine for 7 days.Naloxone challenge significantly increased the frequencies of certain behavioral performances Continue Group Digging body Paw licking Face grooming Penile grooming Scratch Extend Weight loss/g Saline 1.33 ±0.24 2.89 ±0.42 5.89 ±0.54 0.78 ±0.28 5.00 ±0.67 4.11 ±0.35 0.26 ±0.13 Naloxone 3.40 ±0.34＊＊ 7.40 ±0.64＊＊ 9.80 ±0.74＊＊ 4.80 ±0.51＊＊ 10.20 ±0.90＊＊ 4.50 ±0.45 0.75 ±0.03＊＊WAY 2.25 ±0.53 7.25 ±0.53＊＊ 6.25 ±0.59 2.25 ±0.41 8.25 ±0.62* 3.75 ±0.37 0.69 ±0.05*

Tab 3 WAY attenuates naloxone-precipitated withdrawal in morphine-dependent mice(±s，n=10)

Tab 3 WAY attenuates naloxone-precipitated withdrawal in morphine-dependent mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs saline group

Group Burrowing Jumping Body grooming Rearing “Wet dog”shakes Head shakes Saline 6.10 ±0.43 22.30 ±1.93 12.70 ±0.88 3.00±0.33 5.70 ±0.70 9.30 ±1.03 WAY(0.5 mg·kg－1) 3.10 ±0.31＊＊ 9.80 ±1.00＊＊ 8.80 ±0.88* 1.70 ±0.30* 2.80 ±0.51＊＊ 4.50 ±0.81＊＊WAY(0.75 mg·kg－1) 1.70 ±0.34＊＊ 5.90 ±0.88＊＊ 7.00 ±0.92＊＊ 1.00 ±0.33＊＊ 1.60 ±0.40＊＊ 2.00 ±0.54＊＊WAY(1.0 mg·kg－1) 0.90 ±0.23＊＊ 2.40 ±0.65＊＊ 6.80 ±0.85＊＊ 0.60 ±0.22＊＊ 0.70 ±0.21＊＊ 1.10 ±0.35＊＊Clonidine(0.2 mg·kg－1) 1.40 ±0.22＊＊ 2.70 ±0.52＊＊ 6.60 ±0.76＊＊ 0.90 ±0.31＊＊ 0.80 ±0.29＊＊ 1.30 ±0.30＊＊Continue Group Digging body Paw licking Face grooming Penile grooming Scratch Extend Saline 4.00 ±0.60 9.10 ±1.05 12.10 ±0.84 2.50 ±0.34 11.00 ±1.03 4.30 ±0.47 WAY(0.5mg·kg－1) 3.10 ±0.48 8.70 ±0.82 3.80 ±0.33＊＊ 1.40 ±0.31 7.60 ±0.80* 3.80 ±0.42 WAY(0.75mg·kg－1) 2.90 ±0.53 8.50 ±0.60 3.50 ±0.43＊＊ 1.30 ±0.45 4.20 ±0.70＊＊ 2.80 ±0.47 WAY(1.0 mg·kg－1) 3.00 ±0.58 9.00 ±0.70 3.60 ±0.52＊＊ 1.10 ±0.28 2.10 ±0.48＊＊ 2.60 ±0.47 Clonidine(0.2mg·kg－1) 2.70 ±0.42 8.80 ±0.84 4.10 ±0.62＊＊ 1.40 ±0.31 2.50 ±0.34＊＊3.20 ±0.51

嗎啡戒斷的表達依賴于完整的NE能通路的功能反應以及它的上下游通路［15－16］。急性嗎啡治療抑制NE的藍斑(LC)神經元的活動，突然終止嗎啡治療會導致LC神經元失去抑制作用并且增加放電頻率，并導致戒斷癥狀。5-HT2CR發揮調控作用，在腎上腺素傳輸中起到抑制作用。5-HT2CR激動劑Ro 60-0175明顯的抑制NE在額葉皮質的水平，而5-HT2CR 拮抗劑，SB-242084 明顯的增加 NE［17］。同時，Ro 60-0175劑量依賴性地降低LC神經元的放電頻率［18］，這表明5-HT2CR影響中樞交感神經。5-HT2CR的藥理特性已經有報道，主要是作用在GABA能神經元上抑制VTA的DA神經元的活性。我們推測，激活5-HT2CR抑制LC以及參與嗎啡戒斷與在VTA其他腦區具有相同的機制，即通過興奮局部GABA神經元抑制NE能神經元活動，我們需要進一步的實驗來驗證這種假設。

本實驗結果顯示，選擇性5-HT2CR激動劑WAY(0.5～1.0 mg·kg－1)腹腔注射對正常小鼠的自發活動沒有明顯的抑制作用。對嗎啡依賴小鼠自發活動有明顯抑制，對納洛酮催促出現的小鼠嗎啡戒斷癥狀也有明顯的抑制作用。5-HT2CR激動劑WAY(0.5、0.75、1.0 mg·kg－1，i.p.)劑量以及陽性對照藥可樂定(0.2 mg·kg－1，i.p.)能明顯降低納洛酮催促出現的小鼠嗎啡依賴戒斷癥狀。本研究旨在探討5-HT2CR激動劑在嗎啡依賴防治中的作用及其可能作用機制。5-HT2CR信號傳遞有望成為揭示抑制阿片類物質成癮和戒斷反應發生的一種新機制，也將為抑制阿片類物質成癮防治提供藥物作用新靶點。

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