鎳(Ⅱ)配合物與DNA相互作用的研究*

胡喜蘭，路 靜，陸丹丹，施鵬飛，張珍明

(1淮海工學院化學工程學院，江蘇連云港222005;2淮海工學院江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇連云港222005)

苯妥英(5，5-Diphenylhydantion，簡寫為 Hpht)是治療癲癇病的首選藥物。作為生物配體，苯妥英是以N和O原子為配位原子，與過渡金屬形成的配合物有著豐富的立體結構和生物活性［1-3］。鎳是生命科學中極為重要的生命元素，是生物體內必需的痕量元素，在氫酶、甲基輔酶M還原酶、一氧化碳脫氫酶、超氧歧化酶和尿酶中均發現其活性中心含有鎳離子［4-6］。因此，模擬合成生命體系中過渡金屬與苯妥英配體形成的配合物對其結構和性能進行研究，對揭示金屬酶的結構，開發療效高、活性強、毒性小的新藥具有重要的意義［7-10］。為此我們利用水熱法，以苯妥英及1，2-丙二胺為配體與醋酸鎳反應，合成得到了一個新穎的三元鎳配合物［Ni(pht)2(pn)2］［11］，利用電子吸收光譜法、溴化乙錠熒光分析法以及粘度測定研究了此種配合物與DNA的相互作用，為進一步的研究打下了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

配合物的元素分析由Perkin Elmer2400型元素分析儀測定;配合物的紅外光譜由WGH-30/6型雙光束紅外分光光度計(KBr壓片)測定;島津UV-2550型紫外可見分光光度計;日立F4500型熒光光譜儀，激發波長為525nm，掃描速度15nm·s-1，在220nm～900nm測量發射熒光光譜。小牛胸腺(CT-DNA，生化試劑，sigma公司);三羥甲基氨基甲烷(分析純，天津市福晨化學試劑廠);溴化乙錠(EB，生化試劑，Fluka公司);醋酸鎳、1，2- 丙二胺、苯妥英、無水乙醇等均為分析純試劑;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 配合物的合成及表征

配合物按文獻［11］進行合成，得到淡紫色的塊狀晶體，其熔點大于573K;產物按C36H42N8NiO4計算的理論值(%):C 60.94，H 5.97，N 15.79;元素分析的測定值(%):C 61.56，H 6.09，N 16.46。IR(KBr壓片，cm-1):3346，3178，2960，2876，1629，1493，1450，1263，1122，961，759，698，603，533。該晶體幾乎不溶于水、醇，稍溶于二甲基甲酰胺(DMF)。性質測定中配合物用少量DMF溶解后用Tris緩沖溶液定容至一定體積，備用。

1.3 配合物與DNA作用的紫外吸收光譜研究

分別往樣品池與參比池中加入2mL Tris-HCl緩沖溶液 (CTris=50mmol·L-1，CNaCl=10mmol·L-1，pH=7.42)，進行基線掃描，然后用2mL的DNA溶液取代樣品池的緩沖溶液進行掃描，再依次往樣品池和參比池中加入一定體積的配合物，每加一次掃描一次。

1.4 配合物對EB-DNA體系熒光強度的影響

在溶液中，EB(ethidium bromide)能平行的插入到雙螺旋DNA結構的堿基之間而產生較強的熒光。然而，當EB被其他能插入到DNA雙螺旋結構中的分子擠出來時，整個體系的熒光顯著降低，因此可通過測定配合物對EB-DNA體系的熒光光譜的影響來研究配合物與DNA的作用。在EB-DNA體系(CEB/CDNA=0.5)中，每次加入一定體積的的配合物，以525nm為激發波長，在550nm～650nm波長區間記錄每次配合物對EB-DNA體系的熒光強度變化。

1.5 配合物與DNA作用的粘度測定

粘度測量時，將溫度恒定在(25±0.1)℃進行。測試液相對粘度按下列公式計算:η=(t-t0)/t0，其中t0為緩沖液流經毛細管所需的時間，t為DNA溶液(含濃度不等的配合物)流經毛細管所需的時間，η0為未加配合物時DNA溶液的相對粘度，以(η/η0)1/3對結合比率 r(r=CComplex/CDNA)作圖，可以看到鎳配合物對DNA粘度的影響。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜表征

該配合物的紅外光譜中在3346cm-1、3178cm-1附近的吸收峰為1，2-丙二胺上的N-H鍵上的N-H鍵伸縮振動吸收，在2960cm-1及2876cm-1分別為甲基和亞甲基的吸收，1629cm-1可以確認為苯妥英咪唑環上的羰基吸收峰，與配體苯妥英咪唑環上的羰基吸收峰相比較，藍移了 90cm-1，1493cm-1、1450cm-1為苯環的骨架振動，1263cm-1為C-N的伸縮振動，1122cm-1、961cm-1是苯環的C-H面內彎曲振動，759cm-1、698cm-1為苯環C-H的面外彎曲振動，603cm-1、533cm-1的弱雙峰可確認為 Ni-NH2和Ni-N鍵的伸縮振動，而在配體苯妥英紅外光譜中沒有此吸收，進一步說明了鎳離子與氨基、苯妥英咪唑環上的氮原子形成了配位鍵。

2.2 配合物與CT-DNA作用的紫外光譜

從圖1中可以發現在260nm左右，CT-DNA在反應前有一較強的吸收峰，這是典型的DNA分子中堿基的紫外吸收，配合物在此也有吸收，CT-DNA與該配合物反應之后(如圖1)，呈現了較明顯的減色效應，當加入 440μL配合物(r=CComplex/CDNA=1.78)時，其減色率達到了8.56%，這可能是由于配合物插入到DNA堿基之間，配體的空π軌道與DNA堿基填有電子的π軌道發生耦合，使π→π*軌的能量下降導致躍遷幾率減小而產生減色效應，可認為是配合物與DNA之間存在一種插入作用［12-15］。

圖1 DNA在不同配合物濃度作用下的電子吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of the DNA upon addition of the complex:1.0 ×10 －4mmol·L －1CT-DNA.r=0，0.32，0.81，1.78，2.75

2.3 配合物與EB-DNA體系的熒光光譜

從圖2中其中可以看出在EB-DNA體系中隨著配合物濃度的增大，即r(r=Ccomplex/CDNA)值的增大，EB-DNA的熒光強度逐步被猝滅，說明配合物與DNA作用后，將EB從EB-DNA復合物中擠出，由此推測配合物中的苯妥英配體可能與DNA發生了部分插入作用。圖3中I0為EB-DNA的熒光強度，I為加入配合物后EB-DNA的熒光強度，從圖3中可以看出當r＞3.3時，體系的熒光強度減弱為50%，說明該配合物與DNA發生了插入結合作用［12-14］，這與紫外吸收光譜分析所得的結果是一致的。

圖2 配合物對EB-DNA體系的熒光光譜的影響Fig.2 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EB-DNA system From top to bottom show the absorbance changing upon the increase in complex concentration，r:(0)0.79，(1)1.58，(2)2.37，(3)3.16，(4)3.95，(5)4.74，(6)5.53，(7)6.32，(8)7.11

圖3 配合物對EB-DNA體系的熒光猝滅Fig.3 Emission quenching of the complex to the EBDNA system plots of I0/I vs r for the titration of DNA with the complex;r:(0)0.79，(1)1.58，(2)2.37，(3)3.16，(4)3.95，(5)4.74，(6)5.53，(7)6.32，(8)7.11

2.4 配合物與DNA作用的粘度分析

粘度法一般認為是檢測配合物與DNA結合方式的重要依據之一。從配合物與DNA作用的粘度(圖4)判斷該配合物是以插入方式與DNA相互作用的［12-14］。這一結果也與前面的紫外吸收光譜和熒光分析的結果相一致，進一步說明該配合物與DNA發生了插入結合作用。

圖4 DNA相對粘度隨配合物加入量的變化Fig.4 Effects of increasing amounts of the complex on the relative viscosity of DNA

3 結論

三元配合物［Ni(pht)2(pn)2］可能是以插入方式與小牛胸腺DNA結合的。

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