腦性癱瘓動物模型造模方法研究進展*

何 琪，邰先桃，張星賀，董美辰

（云南中醫學院，云南 昆明650500）

腦性癱瘓（Cerebral palsy，CP）簡稱腦癱，是一組持續存在的中樞性運動和姿勢發育障礙、活動受限癥候群，這種癥候群是由于發育中的胎兒或嬰幼兒腦部非進行性損傷所致。患兒還常伴發許多其他的障礙，如感覺、知覺、認知、交流、和行為障礙，以及癲癇和繼發性肌肉、骨骼問題[1].在發達國家新生兒CP發病率為2‰，甚至更高[2]，我國腦癱發病率有逐年增多的趨勢[3]。CP 不僅嚴重影響了患兒的正常生長發育、社會交往、學習和生存的能力，而且造成了家庭和社會的經濟負擔，是一個重大的衛生經濟問題。目前CP 的發病機制尚未完全，也無相應的有效的治療策略。為了對該CP 進行有效的預防和診斷治療，研究并明確CP 發生發展機制至關重要，而有效而實用的CP 動物模型的制備是前提。因此，本文從CP 動物模型的制作和評估方法兩方面進行綜述。

1 CP 模型動物的選擇

目前，國內外報道的運用于CP 模型的動物主要有羊、豬、兔和鼠等。腦白質損傷（White matter injury，WMI）是腦損傷的主要病理變化之一，能導致髓鞘損傷和神經纖維不能髓鞘化等，從而導致CP患兒慢性神經功能障礙[4]，發育中的大腦在缺氧缺血時特別容易形成腦白質的損傷，而胎羊的腦白質發育在生理和解剖方面與人類有很多共通之處，從而為研究復雜的人類腦損傷的病理生理過程提供了途徑[5]。

新生豬在生長發育、血液循環、新陳代謝等各方面與新生兒相似。相關研究發現，新生豬在出生7d內，大腦的發育成熟度與人類新生兒相近，在磁共振頻譜分析上，新生豬的波峰特點也與人類新生兒相吻合，因此我們可以選用新生豬來作為實驗動物，模擬人類新生兒大腦缺氧缺血性時的病理變化[6]。

大鼠神經解剖與人類極為接近[7]，且鼠的大小合適、繁殖能力強、抗感染能力強、實驗方便和比較經濟；大鼠腦組織體積小，便于取材，進行病理切片的觀察，同時，大鼠情緒反應較為敏感，便于進行神經行為學觀察。由于胎羊和新生豬等大型動物不易獲得、易死亡、費用昂貴和飼養條件受到限制等原因，目前大多選用鼠做為實驗CP 模型動物。

2 CP 模型造模方法

小兒CP 的病因常被總結為窒息、早產和核黃疸等因素[8]。目前CP 模型的造模方法基本可分為頸總動脈結扎法、宮內感染法、神經毒素法、宮內缺氧缺血法等。

2.1 頸總動脈結扎法

缺氧缺血是CP 發生的常見病因。典型的缺氧缺血CP 模型的操作有：參照Adem 等[9-10]的建模方法，使用出生滿7d 的健康Wistar 幼鼠進行模型制備，首先吸入異氟醚麻醉后，用濃度為75%乙醇消毒頸部皮膚，在手術顯微鏡下于頸正中行一長約0.5cm 的縱行切口，然后分離皮下組織和淺筋膜等，頸總動脈位于右側頸動脈三角內，在找到頸動脈和伴行的迷走神經后，將其小心分離，接著以絲線雙重結扎右側頸總動脈并離斷，最后縫合頸部皮膚切口。術后麻醉恢復2h 后，將模型幼鼠放置在由8%O2和92%N2的混合氣體造成的缺氧環境中，時間為2h。隨后在不同的時間點對實驗動物采用動物行為學試驗如平衡木試驗和足印分析等，運動誘發電位及病理檢測等來驗證CP 模型。缺氧可導致腦血流增加，但白質區不如灰質區明顯，腦血流量增加導致代償能量利用，因此缺氧可導致嚴重的腦白質損害。在胚胎早期缺血可引起腦發育畸形，胚胎后期可發生破壞，如孔洞腦、腦軟化癥和無腦性腦積水等，缺氧缺血發生在圍生期可造成腦梗死、腦出血等嚴重損傷。

但是也有部分報道稱該方法更易引起灰質的損傷而非白質，進而提出了雙側頸總動脈切斷的模型，然而，雙側頸總動脈結扎的動物存活率低于單側頸總動脈結扎的存活率[11]。單側頸總動脈結扎法經過多番驗證被認為是一種可靠且穩定的模型[12]。

2.2 宮內感染法

WMI 是早產兒腦損傷最常見的類型，腦白質損傷產生的原因復雜，但炎癥反應在腦白質損傷中產生的作用在近幾年來受到較大重視[13]。近年來，大量研究表明圍產期感染，如絨毛膜羊膜炎和胎兒血管炎不僅是早產的重要原因，同時與早產兒腦損傷的發生密切相關[14]。采取孕鼠腹腔內或子宮頸內注射脂多糖，以建立CP 模型，最為常見，應用最廣泛。

2.2.1 腹腔內注射法

李曉婕等[15]將國外學者的腹腔內注射建立CP模型的方法加以改進，主要步驟有：將24 只Wistar孕鼠分為2 組，實驗組16 只，對照組8 只，實驗組每天注射1 次脂多糖，每次為350μg/kg，連續注射2d，對照組則腹腔注射同劑量的生理鹽水。觀察孕鼠的分娩時間并記錄新生鼠出生體重，凡早于孕22d 出生的新生鼠均視為早產鼠，待新生鼠出生后立即處死分娩后的母鼠，取其子宮和胎盤，通過做HE 染色觀察宮內感染情況來驗證CP 模型是否成功。

2.2.2 子宮頸內注射法

邱洪斌等[16]復制CP 模型的方法是：模型動物選用成熟Wistar 大鼠，孕鼠在受孕第10 天、第15天及第20 天分別代表妊娠早、中、晚的不同時段，對其分組后給藥，給藥時先乙醚吸入麻醉孕鼠，再用陰道擴張器暴露孕鼠子宮頸，將0.1mL 脂多糖溶液用1mL 注射器注射到子宮頸肌肉內（脂多糖溶液濃度為0.1mg/kg 孕鼠體重稱取脂多糖溶于0.1mL生理鹽水中），注射時不可將液體注入子宮腔內，同時確保操作熟練度，每只孕鼠操作時間不得超過2min。

2.2.3 腹腔注射脂多糖合并缺氧法

高峰等[17]的CP 建模方法：選用受孕17dWistar孕鼠經腹腔注射脂多糖，劑量為0.4mg/（kg·d），于注射12h 后將孕鼠置于由8%氧氣和92%氮氣構成的缺氧環境中缺氧2～2.5h，待孕鼠恢復4h 后，再次腹腔注射同劑量脂多糖，最后放回籠中飼養，等待孕鼠自體分娩后將生下的乳鼠和母鼠同籠飼養。Hu 等[18]采用腹腔注射脂多糖宮內感染合并全身缺氧的方法建立一種微創傷、簡單易行、成功率高、逼真模擬人類胎兒在圍產期缺血缺氧過程的CP 動物模型。

2.3 神經毒素法

膽紅素血癥時，膽紅素通過血腦屏障，損害中樞神經系統，病變特點在腦基底核、海馬、視丘下核和齒狀核等被感染成亮黃或深黃色。鏡下觀察上述部位的神經細胞核小膠質細胞不同程度變性，大量神經元丟失和神經膠質細胞增生替代。孫葉強等[19]的CP 建模方法是：給2 組實驗組仔兔分別腹腔注射膽紅素100 mg/kg、300 mg/kg，正常組及給藥后的實驗組由母兔自然哺育45d。通過神經學檢查和病理性檢查，發現其中部分仔兔有明顯運動姿勢異常，其病理改變也同人類相似，提示腹腔注射膽紅素300 mg/kg 能造成仔兔腦損傷并致CP。

2.4 宮內缺氧缺血法

宮內缺氧缺血法是近幾年研究的較多的方法之一，模型動物多選用健康新西蘭白兔，Drobyshevsky等[20]的方法是選用妊娠22d 的新西蘭白兔，使用芬太尼（75μg/kg·h-1）和氟哌利多（3.75mg/kg·h-1）靜脈復合麻醉，隨后用0.75%布比卡因腰麻，沿著左側腹股溝中點切開皮膚，分離股動脈和其他軟組織后，在股動脈上做一縱行切口，由此插入一球囊導管，進入下行的主動脈至上段子宮動脈。期間用直腸溫度探頭監測體溫。氣囊充氣40min，導致子宮缺血和隨后的宮內胎兔全腦缺氧缺血。待缺氧缺血期結束時，將氣囊放氣，造成子宮灌注和胎兒腦組織再灌注的復氧期，最后取出導管，修復股動脈，使其恢復。

國內的做法也大同小異，王能里等[21-22]則是在氣囊內注入生理鹽水，且發現動脈供血阻斷的時間越長，隨之造成的腦損傷程度也不同。根據雌兔孕期長短的不同，子宮動脈血流阻斷時間也要相應改變。孕26d 的雌兔子宮供血阻斷的時間可以長達35～37min，而孕29d 的雌兔最佳的阻斷動脈供血的時間應該為25～28min，當時間延長到40～50min，死胎率可以達到100%，合理的時間能控制死胎率同時造成理想的腦白質損傷和神經行為學的異常。

2.5 腹腔注射合并缺氧缺血法

Alexandre Savard 等[23]的模型制備方法是待孕鼠自然生產后，于第12 天給予乳鼠腹腔注射脂多糖（按200 μg/kg 稀釋于50μL 生理鹽水中），乳鼠恢復4h 后異氟醚麻醉進行右側頸總動脈結扎術，使用加熱墊使溫度保持在37℃，回籠休息30min 后將幼鼠置于8%O2的缺氧空間內1.5h，溫度保持為37℃。研究發現將腹腔注射脂多糖與缺氧缺血相結合時，能造成更嚴重的腦損傷，并且當缺氧時間超過3h 后，乳鼠死亡率達到最高值[24]。

2.6 其他CP 模型

除以上幾種動物模型外，還有采用電損毀錐體束建立一側肢體痙攣性CP 的模型。實驗動物選用健康SD 大鼠，大鼠腹腔麻醉后固定在大鼠腦定位儀上，電極陽極針連接定位儀備用，大鼠頭頂備皮，同時鼠尾部插入電極陰極針，在頭頂后正中行一約3cm 的切口，逐層切開，暴露前囟和矢狀縫，根據大鼠腦癱立體定位圖定位，用骨鉆穿透顱骨，再垂直刺入電極針進行電刺激，隨后拔針止血，用骨蠟封住鉆孔，最后縫合傷口[25]。由于動物模型癥狀不典型或癥狀持續時間較短，李亮等[26]采用顱內注射無水乙醇的方法制作痙攣性CP 模型。這種方法在定位后，使用微量注射器在顱內注射無水乙醇造成模型動物錐體束壞死，研究中發現注射劑量為15μL 時效果較好，能較好地模擬痙攣性CP 的生理病理改變。

3 模型評估方法

現有的模型評估方法主要有動物一般情況評估法、行為學評估法及病理檢測法等。

3.1 一般情況觀察

模型動物一般情況觀察主要包括間斷體重測量、幼鼠出生時及后期皮膚顏色、每日活動量等，可以反映模型動物出生及后期的生長情況。

3.2 行為學評估法

動物行為學是判斷造模成功與否的重要觀察指標，從檢測目的來看，基本可分為感覺運動類和學習記憶類。感覺運動類即觀察動物運動發育情況，常用方法有平衡木、足印試驗、翻身實驗、懸吊實驗、斜坡實驗、旋轉試驗、圓筒試驗、曠場試驗等；學習記憶類主要包括水迷宮試驗、穿梭試驗等[27-29]。其中運用最多的主要是曠場試驗和水迷宮試驗，前者用來評估全腦結構的完整性，后者用來評估海馬的空間學習和記憶能力[30]。

3.3 病理切片鑒定法

病理切片是判斷造模成功與否最確切的證據。首先對造模成功的模型動物使用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭剝取腦組織，放入4%多聚甲醛溶液內固定，換蔗糖溶液至腦組織沉入瓶底，截取所需腦組織制成5μm 厚石蠟切片行HE 染色，分析切片。常可見到的異常是白質與灰質、海馬區界限不清，海馬區無規整緊實排列的單層神經元細胞層，神經元數量少，發育不成熟等[31]。

4 小結

研究急性和亞急性的生理和代謝機制的CP 模型多選用胎羊和新生豬等動物，而嚙齒類動物和靈長類動物多被運用于觀察長期的神經病理學及行為學的CP 建模。宮內缺氧缺血法的優點在于不僅能逼真的模擬新生兒在子宮內獲得的全腦缺氧缺血性病理損傷，并且能誘發胎兔在神經行為學上的病理性異常改變，但其不足同子宮頸注射脂多糖的方法一樣，實驗過程復雜，加大了實驗的難度和不確定性；腹腔注射脂多糖造成宮內感染的方法簡便易行，同樣能模擬胎兒在母體子宮內獲得的感染，但我們在實踐過程中發現宮內感染的模型制備方法可重復性較低，難以制作出符合條件的腦癱模型，而其他的模型制作方法尚不成熟。綜上所述，最為經典的是單側頸總動脈結扎的方法，該法自發表以來已被國內外學者廣泛采用，已經趨向成熟穩定，且實驗簡便易行，可重復性好，是目前缺氧缺血性腦病模型優先選擇的方法之一。在模型評估方面，無論用動物行為學還是病理切片方法，一般情況觀察的均不可少，動物行為學評估法還要根據實際需要選擇合適的行為學實驗方法。

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