多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的主動(dòng)外排泵基因?qū)Ζ?內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性的影響*

孫靜娜，楊繼章，王國(guó)欣，趙帥，劉澤世，張征

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.藥學(xué)部，石家莊 050031)

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的主動(dòng)外排泵基因?qū)Ζ?內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性的影響*

孫靜娜1，楊繼章2，王國(guó)欣1，趙帥1，劉澤世1，張征1

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.藥學(xué)部，石家莊 050031)

目的 探討對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵基因在耐藥機(jī)制中表達(dá)情況。方法 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌96株，分析其對(duì)9種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性。以加入泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)后最低抑菌濃度(MIC)降低至≤1/4為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出34株外排泵表型陽(yáng)性的鮑曼不動(dòng)桿菌，用聚合酶聯(lián)鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增法對(duì)其行外排泵蛋白基因adeB進(jìn)行檢測(cè)和分析。結(jié)果 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%；對(duì)氨芐西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為90.1%，77.5%，72.4%和67.3%。34株外排泵表型陽(yáng)性的鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到adeB基因有33株，檢出陽(yáng)性率97.06%。對(duì)33株鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵基因adeB進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與Genebank中序列同源性為100.0%。結(jié)論 主動(dòng)外排泵基因是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的一個(gè)重要因素。

鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；外排泵；β-內(nèi)酰胺酶

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在住院患者，尤其在重癥監(jiān)護(hù)室、嚴(yán)重?zé)齻》康哪退幘甑某霈F(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來(lái)很大困難。其中，多藥外排系統(tǒng)是鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的一個(gè)重要原因。特別是AdeABC外排泵參與了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基苷類藥物、β-內(nèi)酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。筆者通過(guò)96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性進(jìn)行分析，探討鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵基因adeB在其耐藥機(jī)制中的作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)所用菌株來(lái)自2012-2013年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院不重復(fù)菌株96株，其中來(lái)自下呼吸道標(biāo)本76株，尿道分泌物標(biāo)本11株，血液標(biāo)本4株，尿液標(biāo)本3株，炎性分泌物標(biāo)本2株。進(jìn)行純培養(yǎng)后，經(jīng)法國(guó)梅里埃公司Vitek32全自動(dòng)微生物檢測(cè)儀鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.2 試劑 藥敏紙片：頭孢他啶(CAZ，每片30 μg)、 頭孢哌酮/舒巴坦(SCF，每片75或10 μg)、頭孢噻肟(CTX，每片30 μg)、頭孢吡肟(CPR，每片30 μg)、頭孢曲松(CRO，每片30 μg)、氨芐西林(AMP，每片10 μg)、哌拉西林(PIP，每片100 μg)、氨芐西林/舒巴坦(SAM，每片各10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP，每片100/10 μg)。K-B法藥敏紙片均為英國(guó)OXID公司產(chǎn)品。

AST-GN 藥敏卡和GN鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)，泵抑制劑羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone，CCCP)和泵抑制劑溶解試劑二甲亞砜(河北博世林公司)，引物合成 adeB(委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，DNA提取 Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit 試劑盒(Promega公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 GoTaq?Green Master Mix、GoTaq?Colorless Master Mix(美國(guó)Promega公司)，DNA染色劑 Goldview，DNA Ladder Marker(北京賽百盛公司)，瓊脂糖X-gal(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.3 儀器 MaxweII-16核酸提取儀(美國(guó)Promega公司)；Mini-4K/6K 微型離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；AB 9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)AB公司)；DYY-12電泳儀(北京六一儀器廠)；VilBer LouRMAT凝膠成像系統(tǒng)(法國(guó)VILBER LOURMAT公司)；SIGMA 3-18K臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥敏實(shí)驗(yàn) 按照2012年M02-A11臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的Kirby-Bauer法，對(duì)CAZ、SCF、CTX、CPR、CRO、AMP、PIP、SAM、TZP進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 外排泵表型陽(yáng)性鮑曼不動(dòng)桿菌的判定 參考Sylvia Valdezate方法，比較應(yīng)用CCCP前后，96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的變化，以加入泵抑制劑后MIC值比不加泵抑制劑降低至≤1/4作為外排泵表型陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB的檢測(cè) 采用PCR技術(shù)檢測(cè)外排泵蛋白基因adeB。adeB基因PCR引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBanK中已發(fā)布的各型基因序列[1]，自行設(shè)計(jì)基因引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約541 bp，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

引物A：5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′(貨號(hào)：AF370885)，引物B：5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′(貨號(hào)：AF370885)。

1.4.4 電泳 緩沖液0.5×TBE，電壓100 V。上樣標(biāo)本量8 μL，DNA分子量Maker(100 bp)8 μL，電泳50 min置于全自動(dòng)凝膠圖像成像儀上觀察結(jié)果并攝像，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶判為陽(yáng)性。

1.4.5 adeB基因測(cè)序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和切下的含陽(yáng)性DNA的凝膠送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 96株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)9種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥情況 見(jiàn)表1。

表1 96株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)9種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥情況

2.2 96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)9種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物MIC的變化 加入泵抑制劑CCCP后，MIC值比不加泵抑制劑降低至≤1/4作為外排泵表型陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選出外排泵表型陽(yáng)性菌34株。

2.3 adeB基因的檢出情況 34株鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到adeB基因的有33株，檢出率為97.06%。

2.4 adeB基因測(cè)序結(jié)果 取正反向雙向測(cè)序結(jié)果一致的序列作為參比序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序比對(duì)序列。adeB基因測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 基因序列比對(duì) 經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與Genebank中序列同源性均為100.0%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌基因組研究發(fā)現(xiàn)，其具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈世界性流行趨勢(shì)，是目前我國(guó)最重要的“超級(jí)細(xì)菌”，也對(duì)全球抗感染領(lǐng)域提出挑戰(zhàn)。由于鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)常可以從各類標(biāo)本中分離出來(lái)，所以成為引起院內(nèi)感染的最為重要的機(jī)會(huì)致病菌。鮑曼不動(dòng)桿菌通過(guò)酶機(jī)制、外排泵、抗?jié)B性等極容易形成耐藥菌株[2]。主動(dòng)外排泵由菌體細(xì)胞膜表面蛋白組成，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的藥物排到細(xì)胞外，外排泵的過(guò)度表達(dá)可以引起鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性改變[3]。adeABC外排泵系統(tǒng)是引起鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的重要因素[4]。

筆者選取常用的3種第3代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松)和1種第4代頭孢菌素(頭孢吡肟)，結(jié)果顯示第4代頭孢菌素的耐藥率較第3代頭孢菌素的耐藥率略低，但鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)4種頭孢菌素的耐藥率均較高，提示臨床醫(yī)生在針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染時(shí)，一定要根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇抗菌藥物。依據(jù)《中國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)》中制定的鮑曼不動(dòng)桿菌感染的抗菌治療原則，選用含β-內(nèi)酰胺酶抑制藥舒巴坦、他唑巴坦的復(fù)合制劑，如氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦等，對(duì)于嚴(yán)重感染者可根據(jù)藥敏結(jié)果與米諾環(huán)素、阿米卡星等藥物聯(lián)合使用。目前，國(guó)內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌感染單用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物已顯無(wú)效。

當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的bla(TEM-2)或攜帶AmpC酶時(shí)，都會(huì)引起菌株對(duì)青霉素類藥物的耐藥，而選用含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦、他唑巴坦的復(fù)合制劑，如氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦時(shí)，其耐藥率也較高，表明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)含酶抑制劑的抗菌藥物仍表達(dá)為耐藥，臨床治療效果難以保證，這也顯示外排泵基因的高度表達(dá)，可將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥物主動(dòng)泵出可能是其耐藥的重要因素，而不是β-內(nèi)酰胺酶。

本實(shí)驗(yàn)篩選出34株鮑曼不動(dòng)桿菌，在加入CCCP后，9種抗菌藥物MIC值均明顯降低；34株鮑曼不動(dòng)桿菌可能由于外排泵的存在而產(chǎn)生耐藥，說(shuō)明CCCP對(duì)逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥行之有效。

主動(dòng)外排機(jī)制使藥物非特異性排出，導(dǎo)致多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)。AdeABC外排泵是鮑曼不動(dòng)桿菌最主要的外排系統(tǒng)。AdeABC外排泵由在染色體上按順序排列的結(jié)構(gòu)基因adeA、adeB、adeC編碼的膜融合蛋白AdeA、外排蛋白AdeB、外膜通道蛋白AdeC形成的三聯(lián)體組成[5]。約80%的鮑曼不動(dòng)桿菌含有adeABC操縱子，從而控制adeABC的過(guò)度表達(dá)，降低喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氨基苷類藥物的敏感性[6]。于翠香等[7]也認(rèn)為，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶外排泵基因，可能是這些菌株高耐藥原因之一。

本研究通過(guò)對(duì)34株外排泵表型陽(yáng)性鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行AdeABC外排泵的跨膜組件AdeB基因測(cè)定，檢測(cè)到adeB基因有33株，檢出陽(yáng)性率較高，表明主動(dòng)外排泵基因是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的一個(gè)重要因素。取正反向測(cè)序結(jié)果一致的序列作為參比序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序比對(duì)序列，經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與Genebank中序列同源性均為100.0%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。表明AdeABC外排泵機(jī)制在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性尤其重要。含有adeB基底泵的重組衍生體，相對(duì)于不含adeB基底泵抗菌藥物的敏感性降低。此外，結(jié)構(gòu)基因的失活，尤其是編碼轉(zhuǎn)錄蛋白的adeB，外排泵活性的增強(qiáng)以及不同的外排泵之間相互作用，外排泵抑制劑在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)不同抗菌藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用仍有待研究。

本實(shí)驗(yàn)研究了β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的靶位、細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的因素及耐藥機(jī)制，可為做好預(yù)防細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、提高臨床β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物使用效率提供參考，同時(shí)為研制開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物提供參考。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.009

Effects of the Active Efflux Gene on Multidrug Resistance ofAcinetobacterBaumanniito Beta Lactam Antibiotics

SUN Jingna1,YANG Jizhang2,WANG Guoxin1,ZHAO Shuai1,LIU Zeshi1,ZHANG Zheng1

(1.ClinicalLaboratory;2.DepartmentofPharmacy，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031，China)

Objective To investigate the effect of expression of active efflux gene on multidrug resistantAcinetobacterbaumanniiin the course of resistance to beta lactam antibiotics. Methods Drug resistance of 96 strains of multidrug resistantAcinetobacterbaumanniito nine beta lactam antibiotics was analyzed.A total of 34 efflux phenotype positive strains were isolated according to the standard that the MIC level was reduced by more than 75 percent when the carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone inhibitors were added.The efflux pump protein gene adeB was detected, analyzed and sequenced by the method of PCR amplification. Results The antibiotic resistance rate to cefotaxime, cefiazidime，ceftriaxone，cefepime, cefperazone/sulbactam were 92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%, respectively.The resistance rate to ampicillin, piperacillin, piperacillin/tazobactam and ampicillin/sulbactamare were 90.1%, 77.5%, 72.4%，67.3%, respectively.The adeB genes were detected in 33 stains out of 34 of the efflux pump phenotype positive strains, and the positive rate was 97.06%.The 33 strains were sequenced for adeB efflux pump gene.We found the sequence homology was 100.0% match with Genebank. Conclusion Active efflux pump gene inAcinetobacterbaumanniiplays an important role in multidrug resistance to beta lactam antibiotics.

Acinetobacterbaumannii; Multidrug resistance; Efflux pump；Beta lactamase

2014-05-06

2014-06-02

*河北省科技廳科技支撐計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(112061178D)

孫靜娜(1976-)，女，河北保定人，副主任檢驗(yàn)師，碩士，主要從事微生物學(xué)研究。電話：0311-85917323，E-mail：787164547@qq.com。

楊繼章(1957-)，男，河北邢臺(tái)人，主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床藥理學(xué)研究。電話：0311-85917352，E-mail：yjzh1957@163.com。

R978.11；R965

A

1004-0781(2015)01-0040-04