mtSSBP1與相關性疾病的研究進展

龍　盤,常　淞(綜述),黃小軍(審校)

(第四軍醫大學 a.航空航天醫學系，b.基礎部教學實驗中心，西安 710032)

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mtSSBP1與相關性疾病的研究進展

龍盤a,常淞a(綜述),黃小軍b※(審校)

(第四軍醫大學 a.航空航天醫學系，b.基礎部教學實驗中心，西安 710032)

摘要：線粒體單鏈DNA結合蛋白(mtSSBP1)是定位于線粒體基質和擬核的同源四聚體，在線粒體DNA的復制、轉錄以及損傷后修復等一系列生物學行為中發揮著重要作用。當mtSSBP1表達失調時，mtDNA發生基因突變，尤其是處于惡劣的環境條件下，如高氧化應激、水解脫氨基反應、烷基化作用，DNA損傷將大量積累，最終導致多種相關疾病的發生、發展。目前關于mtSSBP1的分子機制及其與疾病相關分子通路的研究正處于探索階段，該文就近年來的研究進展予以綜述。

關鍵詞：線粒體單鏈DNA結合蛋白；結構；功能；腫瘤

線粒體是真核生物細胞內的重要細胞器，是新陳代謝和生物能量轉換的重要場所，在生命活動中發揮著重要作用，同時也影響到細胞的衰老死亡，甚至導致腫瘤或其他人類線粒體遺傳疾病。人類線粒體基因組是由16 569個堿基對組成的環狀雙鏈DNA，mtDNA 編碼呼吸鏈中與氧化磷酸化過程相關的多個蛋白質，因此線粒體基因組的完整性對于生物體有重要意義。同時，線粒體又受到多種核基因產物的調控，目前在線粒體中發現多種DNA-蛋白質復合物參與線粒體的復制、轉錄和損傷后修復，如mtDNA聚合酶γ(mtDNA polymerase gamma,POLG)、線粒體單鏈DNA結合蛋白(mitochondria single-strand DNA protein 1，mtSSBP1)、線粒體DNA解旋酶(TWINKLE)、連接酶、拓撲異構酶、線粒體轉錄因子A，而mtSSBP1作為其中調節因子發揮著重要作用。現就mtSSBP1的功能和功能異常導致的相關疾病予以綜述。

1mtSSBP1的介紹

mtSSBP1以往也稱mtSSBP，是由148個氨基酸組成的同源四聚體結構，主要定位于線粒體基質和擬核。兩個結構域分別是核酸結合區和PriB蛋白/單鏈DNA結合區[1]。人類mtSSBP1定位于第7號染色體長臂3區4帶，由49 602個堿基對組成，由4個外顯子和3個內含子組成，廣泛分布于血液系統、神經系統、肌肉組織中。由于線粒體起源于單細胞生物與細菌的“內共生體”，mtSSBP1在進化上是保守的，它與原核生物和噬菌體的SSB蛋白屬于同族[2]。在與原核生物的SSB的結構比較中發現，一些原核生物，如大腸埃希菌的SSB并沒有C端結構域，說明在進化過程中mtSSBP1結構更趨完整，功能也更為復雜[3]。

2mtSSBP1的功能

與細胞核DNA復制方式類似，mtDNA也是半保留復制。在TWINKLE的作用下，雙鏈環狀mtDNA解鏈形成ssmtDNA、mtSSBP1和POLG、TWINKLE等蛋白因子互相作用，共同參與mtDNA的復制。研究發現，mtSSBP1通過特異性活化TWINKLE，可提高mtDNA前體的解鏈速度[4]。 體外實驗發現[5]，mtSSBP1通過增加POLG的前體識別能力，提高了POLG的活性，同時，促進了在mtDNA鏈延長過程中POLG的持續合成。Oliveira和Kaguni[6]通過突變mtSSBP1的特定堿基得到5種變異的mtSSBP1，熒光素標記后觀察mtSSBP1、POLG以及ssmtDNA之間相互作用的三維結構模型，發現mtSSBP1通過不同結構域與POLG和TWINKLE相互作用，一旦mtSSBP1形成變異體后將與POLG和TWINKLE的結合發生缺陷，導致mtDNA的復制受到抑制。Kaguni和Kaguni[3]為了探究mtSSBP1的C端和N端的作用，通過基因敲除獲取了C端和N端缺失的mtSSBP1，發現缺失了C端和N端結構的mtSSBP1對mtDNA的復制產生抑制作用。

2.1mtSSBP1與線粒體單鏈DNA結合調控線粒體基因組的復制每個真核細胞中大約有10個線粒體，而每個線粒體中有10～100個mtDNA[7]，那么mtDNA拷貝數目在細胞分裂過程中是如何保持恒定的？與核DNA一樣，mtDNA復制時形成復制叉，目前發現只有3種蛋白參與了復制叉的形成與維持：TWINKLE、POLG和mtSSBP1。mtDNA復制首先需要TWINKLE打開DNA雙鏈，只要單鏈DNA形成，SSBP1便會選擇性地與單鏈DNA結合并將其覆蓋，阻止單鏈DNA退火形成雙螺旋，維持DNA單鏈狀態以保證復制進行。不僅如此，SSBP1與單鏈DNA結合還可以增強TWINKLE和POLG的活性。研究發現[5]，各種無功能的SSBP1突變體不僅可以導致單鏈DNA形成障礙，同時也引起TWINKLE和POLG活性的低下，表明SSBP1在mtDNA復制叉的形成和維持過程中發揮重要的協調作用。

2.2mtSSBP1參與mtDNA轉錄mtSSBP1不僅參與mtDNA復制，而且也參與mtDNA的轉錄，由于線粒體基因除D-loop區外均不含內含子，轉錄產生了多順反子的結構。在解鏈過程中，mtSSBP1結合了線粒體sNA并移位保證轉錄順利進行。研究發現[8]，線粒體轉錄因子A和mtSSBP1共同作用于D-loop環，mtSSBP1通過構象改變激活信號通路募集線粒體轉錄因子A等一系列蛋白，從而啟動轉錄。為了進一步探索mtSSBP1的轉錄功能，有研究以秀麗隱桿線蟲為生物模型，利用RNAi抑制mtSSBP1表達，發現79%的F1秀麗隱桿線蟲完全不育，并伴有生殖細胞前體的抑制，最終均導致線粒體數目減少；同時，細胞處于缺氧狀態，線粒體氧化復合體Ⅲ表達低下，缺氧誘導因子1表達增高。推測可能是由于mtSSBP1合成減少抑制了mtDNA的轉錄和翻譯[9-10]。

2.3mtSSBP1參與mtDNA的保護與損傷后修復mtDNA缺乏有效的基因修復系統，而且自身結構存在缺陷，這使之極易受損。其原因可能有以下幾點：①mtDNA通常是裸露的，不受組蛋白的保護，所以致癌物質易于與之結合。②線粒體內脂質含量較高，使具有嗜脂性的致癌物質往往優先在mtDNA上聚集。③mtDNA在整個細胞周期中處于不斷的合成狀態，易受外界因素的干擾，穩定性差。④線粒體內氧濃度較高，易產生氧自由基及過氧化氫等物質，其本身又不能合成谷胱甘肽將此類物質有效去除，因此mtDNA易受氧化物損傷，造成核酸片段丟失、堿基修飾及插入突變等。⑤在復制時由于POLG的校對性差，以及tRNA基因部位易形成發夾樣結構，導致其復制錯配頻率高于核DNA約10倍。

研究發現[5,11]，mtSSBP1主要通過以下兩種機制參與mtDNA的保護和損傷后修復。

2.3.1mtSSBP1物理隔離mtSSBP1可保護mtDNA，免于核酸酶的損傷，在復制開始時，mtSSBP1首先識別位于重鏈的起始點，然后像外套一樣包裹在線粒體sNA上，防止單鏈內配對成環而形成二級結構，這對線粒體這樣一個除D-loop區外，相鄰的基因之間幾乎無任何非編碼堿基的“經濟型”基因來說起到至關重要的保護作用。研究還發現，mtSSBP1和線粒體轉錄因子A相互協調，共同穩定mtDNA的D-loop，從而降低了D-loop環處基因的突變率[7]。

2.3.2mtSSBP1抑制在ssmtDNA上的堿基修復當mtDNA受到氧化損傷時，會產生3-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃嘌呤等物質，為防止線粒體DNA堿基損傷的積累，細胞通常利用堿基切除修復途徑。通過3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶識別和切除具體損傷堿基[12]，由嘌呤/嘧啶核酸內切酶1發揮作用，生成一個去嘌呤或去嘧啶的位點，由此產生的間隙由POLG填充和DNA連接酶密封。mtSSBP1就是通過3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶途徑保護mtDNA，通過液相-色譜質譜分析發現mtSSBP1與3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶在線粒體中形成復合物，mtSSBP1在sNA上可以顯著抑制3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶活性，從而防止線粒體sNA發生斷裂[11,13]。Wollen Steen等[13]實驗證實，mtSSBP還可抑制尿嘧啶DNA糖基化酶1和氧化脫甲基酶的活性，從而防止ssmtDNA 上尿嘧啶和3meC的氧化脫甲基被切除；另一方面，mtSSBP也可有效抑制脫嘌呤嘧啶內切核酸酶1和糖基化酶的活化，從而避免在線粒體sNA上產生切口。因此，mtSSBP1在線粒體sNA中起到了防止核酸酶內切形成致命的mtDNA斷裂損傷的作用。mtSSBP1通過以上幾種途徑防止ssmtDNA斷裂的形成。

3mtSSBP1與疾病發生

3.1腫瘤目前解釋腫瘤發生的重要學說是“二次打擊”學說，本質上是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。在體細胞中發現的mtDNA突變表明，人類腫瘤組織中線粒體基因突變以發生在D-loop區尤為頻繁，特別是在被稱為D310區的區域，而mtSSBP1恰好就是作用于D-loop區[11]。mtSSBP1參與了mtDNA的復制、轉錄、保護以及修復過程。因此，若mtSSBP1表達失調，mtDNA會發生基因突變以及突變積累，最終可能會導致腫瘤的發生。目前發現，mtSSBP1與肝癌、乳腺癌以及卵巢癌等多種腫瘤發生有關[14-21]。

3.1.1肝癌研究發現，無論是肝癌組織還是肝癌旁組織都存在mtDNA的突變[14]。而這些突變與mtSSBP1關系密切，mtSSBP1表達失調與甲胎蛋白水平變化、癌旁衛星灶形成、腫瘤體積以及肝癌預后有一定的相關性。Ye等[15]利用蛋白質印跡分析技術和免疫組織化學法對20例肝細胞肝癌患者的線粒體蛋白質組進行分析，與對照組相比，發現其中mtSSBP1和肽基脯氨酰異構酶表達上調，推測可能是由于腫瘤細胞微環境改變，mtSSBP1蛋白不能正確折疊，而且mtSSBP1在肝癌發生過程中的上調可能與Ras-Raf-MEK-ERK通路有關。

3.1.2其他腫瘤越來越多的腫瘤研究發現[22-24]，有70%以上的腫瘤細胞存在mtDNA突變，線粒體中的蛋白質變性失活，其中作為mtDNA的“保護蛋白”mtSSBP1變異率更高。Polyak等[16]對人類10種大腸癌細胞系的線粒體基因組進行了測序，最終在7個細胞系中發現了可能影響體細胞功能的突變，其中就包括mtSSBP1。研究發現[6]，mtDNA 拷貝數與mtSSBP1表達活性呈正相關，這不僅影響mtDNA 的復制速度，還會影響mtDNA的穩定性。Shapovalov等[25]發現，侵襲性很強的腫瘤細胞中mtDNA拷貝數也明顯增加，但是線粒體功能障礙。推測可能是由于mtSSBP1的表達上調使異常mtDNA過度復制，導致積累了大量沒有功能的不成熟線粒體DNA前體。在EB病毒的研究中發現[17]，病毒與線粒體DNA復制的啟動中有共同的起始因子，由于mtSSBP1與病毒的SSB同源，病毒的啟動子與mtDNA的啟動子共同競爭結合mtSSBP1，使EB病毒在裂解性溶細胞周期中抑制mtDNA的復制，導致線粒體DNA拷貝數減少，而這與由EB病毒引發的鼻咽癌有著一定的相關性。研究發現，mtSSBP1作為抑癌基因表達產物鋅指蛋白331的輔助因子可抑制胃癌細胞的生長和侵襲[18]。同時，在卵巢癌的研究中發現，mtSSBP1表達上調，推測可能與腫瘤細胞的高能量代謝有關[19]。目前已知與mtDNA損傷有關的腫瘤包括膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、胃癌等[20-21]。由于mtSSBP1的重要功能，它的變異與mtDNA的損傷有密切關系，但是目前還沒有得到mtSSBP1與細胞癌變直接相關的證據，因此mtSSBP1在腫瘤發生以及診斷中的作用等問題還值得進一步研究。

3.2與腦、心臟、肝臟等重要器官損傷的相關性腦、心肌、骨骼肌、肝臟等器官對氧氣的需求大，依賴性強。因此，當線粒體拷貝數減少或者mtDNA拷貝數減少將導致氧化鏈的必需成分合成減少，就會造成細胞能量供應不足，引起器官損傷。Müller-H?cker等[26]報道1例由肝衰竭導致死亡的16個月男嬰，除發生肝衰竭外，心肌、骨骼肌均嚴重受損，進一步研究后發現是由于POLG和mtSSBP1基因發生突變導致mtDNA耗竭，細胞接受死亡信號啟動線粒體凋亡途徑，使大量細胞同時死亡，最終導致多臟器衰竭。同時有學者發現[27]，老年癡呆癥等一些神經系統疾病可能也與mtSSBP1突變有關，導致神經元中mtDNA表達異常，細胞正常氧化呼吸鏈受到阻斷，使電子傳遞鏈中斷，活性氧類在線粒體中大量積累，損傷mtDNA，最終導致大量神經元凋亡，進一步加劇疾病的發展。

3.3其他可能的相關疾病研究表明[28-29]，線粒體mtSSBP1的突變可能會導致一系列能量代謝相關性疾病的發生，包括常染色體遺傳突變的外部眼肌麻痹、感覺神經病變、癲癇、共濟失調帕金森病等疾病。同時，mtSSBP1與瘋牛病的發生有密切關系，目前已作為自然羊瘙癢癥與瘋牛病的分子標志物[30]。

4結語

mtSSBP1基因是與線粒體功能緊密相關的基因，參與mtDNA的復制和轉錄的啟動、保護mtDNA免受損傷以及損傷后修復等一系列生命活動，與很多疾病密切相關，但具體作用環節以及作用靶點尚未完全闡明。目前，有研究表明mtSSBP1基因與腫瘤的發生、進展以及細胞凋亡有密切關系，若mtSSBP1表達失調，將會抑制以p53為核心的線粒體凋亡途徑[31]。然而在肝癌中，mtSSBP1與凋亡相關性方面的研究還非常有限，相信隨著mtSSBP1在腫瘤凋亡方面的研究更進一步深入，將有望為腫瘤的預防、早期發現以及治療提供新的靶點。

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Studies on mtSSBP1 and Associated DiseasesLONGPana,CHANGSonga,HUANGXiao-junb.(a.DepartmentofAerospaceMedicine,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China;b.DepartmentofBasicExperimentalTeachingCenter,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Abstract:mtSSBP1,the mitochondria single-strand DNA protein,located on the mitochondrial matrix and proposed nuclear with the structure of homo-tetramer,plays essential roles in a series of biological behavior,including the replication,transcription,and the repair after injury of mtDNA.The expression disorder of mtSSBP1 leads to the gene mutation of mtDNA,especially under the harsh environment and conditions,such as oxidation,hydrolytic deamination,alkylation adducts,the accumulation of high levels of mtDNA damage will lead to the generation and development of various related diseases.The study of mtSSBP1 molecular mechanism and diseases related pathways is at the exploration stage at present,and here is to make a review of the recent research advances of mtSSBP1.

Key words:Mitochondria single-strand DNA protein 1; Structure; Function; Tumor

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-04-20編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.010

中圖分類號：R34； R735.7

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3867-04