胃腸胰神經內分泌瘤相關微RNA的研究進展

楊　逸(綜述)，王志剛(審校)

(上海交通大學附屬第六人民普外科，上海 200233)

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胃腸胰神經內分泌瘤相關微RNA的研究進展

楊逸△(綜述)，王志剛※(審校)

(上海交通大學附屬第六人民普外科，上海 200233)

摘要：微RNA(miRNA)是一類具有21～22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過在轉錄后水平調節靶基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程。miRNA具有促癌或抑癌作用，在人類腫瘤的起源與演進過程中起重要作用，充當促癌基因或者抑癌基因作用，是極具敏感性的生物標志物及治療靶點；相較正常組織，miRNA在胃腸胰神經內分泌瘤中亦存在顯著差異表達，具有潛在臨床價值。

關鍵詞：微RNA；神經內分泌瘤；胃腸道；胰腺

神經內分泌瘤(neuroendocrine tumors，NETs)是一類起源于內胚層神經內分泌細胞的腫瘤，以胃腸胰NETs(gastroenteropancreatic NETs，GEP-NETs)最常見，發病率逐年上升[1]。GEP-NETs具有廣泛的異質性，胃、腸、胰各部位NETs樣本量相對不足，導致GEP-NETs的基因學研究未取得突破性進展，同時很多陰性試驗提示包括p53、RB1、KRAS等在實體腫瘤中經典的抑癌或促癌基因，在GEP-NETs中卻少有明顯改變[2-5]。微RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核生物中的非編碼小分子RNA，自1993年發現以來[6]，截止2014年6月，已有28 645種miRNA被miRBase數據庫收錄。miRNA扮演促癌或者抑癌基因的角色，通過負性調控各自相應的抑癌或促癌基因，參與腫瘤發生與發展[7]。miRNA參與GEP-NETs起源和進展，并有望成為GEP-NETs診治過程中重要的生物標記及治療靶點。現就GEP-NETs相關的miRNA研究進展及臨床應用前景進行綜述，以期為GEP-NETs的基礎研究及臨床診治提供新思路。

1miRNA概述

在細胞核內，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，轉錄為長鏈初始miRNA(primary miRNA,pri-miRNA)[8]。研究認為，編碼miRNA的基因轉錄為單順反子或多順反子信使RNA(mRNA)，且其轉錄受到組織特異性主基因的控制，從而保證了miRNA的組織特異性[9]。pri-miRNA經RNaseⅢ內切酶家族的Drosha酶及其輔助因子DiGeorge綜合征危象區基因8(DGCR8)識別和切割，生成具有70～90個核苷酸和莖環結構的前體RNA(precursor RNA，pre-RNA)[10]。pre-RNA在RNA-GTP依賴的輸出蛋白Exportin-5作用下，從細胞核運輸到細胞質，由對雙鏈RNA專一的RNA內切酶Dicer酶剪切成長度為21～22個核苷酸的成熟雙鏈miRNA(miRNA/miRNA*)[11]。雙鏈miRNA(miRNA/miRNA*)繼續在Dicer酶的作用下解螺旋，其中一條鏈(miRNA)結合到RNA誘導的基因沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非對稱RISC，RISC結合到目標mRNA上，通過與特定靶基因mRNA的3′非翻譯區完全或不完全互補配對，導致靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯，從而發揮其對靶基因表達的調控作用[8,12]。以往將雙鏈中與RISC結合的那條鏈稱作主鏈即miRNA，而所謂的miRNA*在miRNA結合后通常被降解，被視為無功能鏈。但越來越多的研究表明，miRNA*不是miRNA 生成過程中一條簡單的無功能鏈，它更傾向于作為一條功能鏈并起重要的生物學作用[13]。研究顯示，miRNA 對基因表達的作用機制遠比目前預期的復雜。miRNA可通過向富含AU序列的mRNA招募蛋白復合物增加靶基因的轉錄；或者與阻礙基因轉錄的蛋白質相互作用，去除靶基因所受的轉錄抑制，從而間接增加靶蛋白的合成[8,14-15]。此外，部分研究還指出miRNA可通過增強核糖體生物活性促進蛋白質合成，或者在細胞周期停滯的情況下，將其對mRNA的抑制作用轉換為激活作用，促進靶基因的轉錄[14,16]。

2miRNA與人類腫瘤

2002年Calin等[17]首次提出了miRNA與人類腫瘤相關，他們在研究慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)時發現，CLL患者常發生染色體13q14丟失。此染色體片段為非編碼基因DLEU2內含子區域，但具有表達miR-15a和miR-16-1的編碼基因，多數CLL患者出現miR-15a/16-1的表達下調或缺失，提示其表達與CLL相關。后續研究顯示miR-15a/16-1下調原癌基因Bcl-2的表達，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，miR-15a/16-1在CLL中扮演抑癌基因的角色[18]。miR-15a/16-1抑癌基因的作用還體現在包括小細胞肺癌在內的多種腫瘤中，它的下調或缺失解除了其對原癌基因Bcl-2、BMI1、CCND2及CCND1等的抑制作用，導致腫瘤細胞增殖及疾病進展[19]。

近年來大量研究顯示，類似miR-15a/16-1，在正常組織中高表達，在腫瘤組織中低表達或缺失的呈抑癌基因作用的miRNA有miR-34/122/375等；而miR-21/155/195/221等在正常組織中低表達或不表達，在腫瘤組織中高表達，呈現促癌基因作用[17-23]。值得注意的是，miRNA具有明顯的組織細胞特異性，相同的miRNA在不同的腫瘤中作用各不同。miR-191 促進A549細胞生長而抑制海拉細胞生長，miR-24促進海拉細胞生長卻抑制A549細胞的生長[24]。miR-21通過下調第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的表達在人肝細胞肝癌中呈現促癌基因功能，但其在人類紅白血病中抑制癌基因KIT的表達扮演抑癌基因角色[8,25]。

3miRNA與GEP-NETs

受制于GEP-NETs臨床樣本不足及細胞株的匱乏，miRNA 在GEP-NETs中的研究報道相較其他腫瘤顯得十分稀少，目前的研究多集中于胰腺NETs(pancreatic NETs,pNETs)及小腸NETs。Roldo等[26]對正常胰腺組織、胰島組織、pNETs組織及胰腺腺泡細胞腫瘤組織進行miRNA表達譜分析，結果顯示胰腺腫瘤組織較非腫瘤組織miRNA103/107明顯上調，同時伴miRNA-155缺失或下調；pNETs同腺泡細胞癌相比，包括miR-125a/99a/99b/125b-1/342/130a/132/129-2/125b-2在內的10個miRNA顯著差異表達。他們認為,上述差異有助于鑒別腫瘤與非腫瘤以及pNETs與胰腺腺泡上皮來源的腫瘤。另外，miR-204在胰島素瘤中特異性高表達，且與胰島素的表達密切相關；miR-21與Ki67指數及肝轉移高度相關[26]。Ruebel等[27]研究發現,miR-133a在小腸NETs從原發到轉移的進程中，出現相應的表達下調，表明其在疾病進展過程中有重要作用。Li等[28]針對小腸NETs中miRNA表達情況的研究顯示，在小腸NETs進展過程中miR-96/182/183/196/200出現顯著上調。上述這些miRNA被認為是pNETs或小腸NETs潛在的分類和預后判斷標志物，對它們進行深入研究，闡明其作用機制和表達變化情況，并制訂可行的臨床檢測策略，將明顯提高pNETs或小腸NETs的檢出率，以及預后判斷的準確性。一項針對結腸腺癌與正常結腸黏膜miRNA 差異表達的研究中，涉及1例結腸NETs樣本，發現包括miR-96在內的38個miRNA在結腸NETs中較正常黏膜顯著上調，且其中僅有6個miRNA在腺癌中出現上調，這提示miRNA的表達檢測可能有助于鑒別結腸NET與腺癌。該研究中上調的部分miRNA(miR-96/182/196a/488)在Li等[29]的研究中也出現了上調[28]，這些miRNA有望成為GEP-NETs深入研究的對象。但需要注意的是，該研究僅涉及1例結腸NET樣本，大樣本量的后續研究十分必要。

4miRNA與臨床實踐

4.1miRNA輔助診斷研究表明，新鮮組織、石蠟樣本、血漿和血清乃至尿液和唾液均可用于檢測miRNA表達情況，這使其具有很好的臨床實用性[13]。miRNA僅有21～22個核苷酸，相比DNA或mRNA而言，其在體內外均具有明顯的長期穩定性，這使運用miRNA分析技術對臨床樣本進行檢測具有很好的敏感性和穩定性，即使在石蠟樣本中，miRNA分析依然具有相當高的敏感性。Nuovo等[30]研究發現，在石蠟樣本上進行原位雜交檢測，可在細胞或者亞細胞水平顯示miRNA的表達情況，這使miRNA檢測有望成為臨床病理學診斷的輔助工具。

miRNA的一項重要特點是具有類似于內分泌激素的特性，它與核仁磷酸蛋白1等RNA結合蛋白一起，經包裝與轉運，以外分泌小體或者突觸小泡的形式被運出細胞，成為循環miRNA，經血液循環及受體細胞內吞作用，與胞內蛋白結合，從而作用于周邊細胞或機體遠隔部位[8,31-33]。循環miRNA具有很高的穩定性和抗性，易于收集和儲存，使其作為生物標志物服務于臨床檢測成為可能[25]。檢測血漿或血清中的特異性miRNA表達情況有助于腫瘤的診斷；部分循環miRNA的表達水平同某些腫瘤的抗藥性相關聯，監測這些miRNA有助于判斷患者對抗腫瘤藥物的敏感性和耐藥情況[19,25]。Matthaei等[34]將胰腺腫瘤囊內液作為分析樣本，研究miRNA的表達譜，他們指出9個miRNA( miR-24/30a-3p/18a/92a/342-3p/99b/106b/142-3p/532-3p)的特征性差異表達可用以鑒別pNETs與胰腺的其他腫瘤(如導管內乳頭狀黏液性腫瘤等)。Li等[35]分析慢性胰腺炎患者、胰腺腺癌患者、pNETs患者和健康人群的血清循環miRNA表達譜，指出miR-1290的下調對于鑒別pNETs和腺癌極具參考價值。

4.2miRNA輔助治療miRNA在腫瘤中的差異表達及其在轉錄后水平調節靶基因表達所表現的抑癌或促癌功能，使其成為腫瘤治療的潛在生物靶點[36]。目前基于miRNA的治療策略大體分為兩類：通過轉染或直接導入人工合成的miRNA，使有抑癌基因特性的miRNA表達上調，從而抑制腫瘤的生長；應用與特異miRNA互補的反義小分子核苷酸與相應的miRNA結合，來沉默或競爭與mRNA的結合，使有癌基因特性的miRNA功能得以阻斷，從而抑制腫瘤的生長[37-38]。Kota等[39]通過腺病毒感染給肝癌模型小鼠全身給予miR-26a后發現腫瘤體積明顯減小。Lanford等[40]研究證實，在小鼠或者靈長類動物中通過全身給予反miR-122的寡聚核苷酸可以改變肝臟脂類代謝以及減少乙型肝炎病毒的復制，從而減輕肝臟損傷，且無明顯不良反應。隨后，他們開展了首例基于miRNA治療策略的臨床試驗(miravirsen or SPC3649)。

5小結

目前，早期診斷及手術切除是GEP-NETs的最佳診治策略。因此，針對miRNA作為GEP-NETs診斷標志物和治療靶點的研究極具臨床前景。當前，GEP-NETs相關miRNA的基礎及臨床研究仍不足，主要面臨的問題有：GEP-NETs起源及演進機制有待研究闡明；miRNA作用機制尚未完全闡明，miRNA與靶基因之間多對多的關系，使得完整揭示其調控網絡較困難；如何安全有效地使用miRNA類似物或其反義核苷酸治療腫瘤仍需進一步研究。相信，隨著這些問題的逐步解開，miRNA必將為GEP-NETs的研究及診治注入新的活力。

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Research Progress and Clinical Application of miRNAs in Gastroenteropancreatic Neuroendocrine TumorsYANGYi,WANGZhi-gang.(DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedSixthPeople′sHospital，Shanghai200233,China)

Abstract:MicroRNAs(miRNAs) are a family of 21-22 nucleotides,non-coding small RNAs that function as posttranscriptional gene regulators.They are involved in critical biologic processes including proliferation,differentiation and apoptosis.A myriad of studies have demonstrated that miRNAs can act as tumor-suppressors or oncogenes in the origin and progress of human neoplasms.Aberrant miRNA expression can be a sensitive hallmark and therapeutic target.It is reported that aberrant miRNA expression is also occurred in the development and progress of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors,which is of potential clinical value.

Key words:MicroRNA; Neuroendocrine tumor; Gastrointestinal tract; Pancreas

收稿日期：2015-01-19修回日期：2015-03-30編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.015

中圖分類號：R656; R735

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3883-04