間充質干細胞及其在臨床中的應用

張星星 鄧常文 屈玉蘭 白 沖

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間充質干細胞及其在臨床中的應用

張星星 鄧常文 屈玉蘭 白 沖

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類中胚層來源的干細胞，具有強大的免疫調節能力的同時無明顯的不良反應而日益成為研究的熱點。全身或局部器官的免疫失調是臨床上眾多疾病的發病機制，MSC的出現為對激素抵抗或無法耐受免疫抑制劑的患者帶來了新的希望。

間充質干細胞 免疫調節能力 臨床應用

由于大多種免疫性疾病的發病機制仍不清楚，臨床治療仍常以激素和免疫抑制劑為主，而對激素耐藥或免疫抑制劑無法耐受很常見，如何更好地治療這些疾病，已成為臨床亟需解決的問題。間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是骨髓中一類非造血干細胞，可以自我更新或分化為骨、軟骨或脂肪組織等多種細胞。MSC在骨髓中生成基質層，是造血微環境的組成部分，起著支持造血祖細胞造血的功能。除了最常用的骨髓來源，MSC還可以從胎盤、脂肪組織、臍帶血及肝中獲得。自從發現它可以抑制T細胞的免疫反應之后，再加上容易分離、體外易擴增且不丟失干細胞潛能等特性，MSC在臨床上的應用逐漸引起關注，有望成為治愈臨床免疫性疾病的新方法。本文主要討論MSC的免疫學特性及在各種疾病治療中的研究進展。

一、MSC的治療機制

1.MSC的遷移：在未受干預的動物體內，骨髓是MSC優先歸巢的器官，但在有炎癥的動物體內，通過血管注射的MSC會優先歸巢至炎癥存在的部位[1～3]。MSC表面雖然缺乏人P-選擇素糖蛋白配體1，但是仍然可以通過與P-選擇素的互動實現在內皮上的滾動而MSC表面表達的CD44和極遲反應抗原4通過血管細胞黏附分子-1黏附在血管內皮上；一旦MSC成功黏附在血管內皮上，則通過包括結合黏附分子、鈣黏素和血小板-內皮細胞黏附分子等一系列復雜的相互作用，使細胞滲出血管進入骨髓間質的細胞外基質，然后經α1整合素和CD44，黏附在透明質酸、層粘連蛋白、膠原蛋白和纖連蛋白等細胞外基質的組成部分上。遷移的方向主要是由趨化分子的濃度梯度決定的。

2.MSC的免疫抑制作用：由于MSC具有免疫抑制的特點，注射MSC已經被用在多種臨床試驗中，來治療移植物抗宿主病及多種自身免疫性疾病。

(1)MSC對固有免疫的影響：MSC表面表達的因子H和其他多種補體調節蛋白，使MSC能免受機體介導的急性和超急性排斥反應的攻擊，但是MSC仍可以被補體小片段如補體C3a和C5a等招募到組織受損區域發揮作用[4]。1)MSC與中性粒細胞：MSC可以削弱中性粒細胞的呼吸爆發，還可以通過IL-6依賴方式延遲靜息、激活中性粒細胞的凋亡，以達到延長中性粒細胞壽命的目的，MSC對中性粒細胞的保護功能對于含有大量具有功能的成熟中性粒細胞器官，比如骨髓、肺來說可能具有重要的保護作用[5]。2)MSC與樹突狀細胞：樹突狀細胞(DC)是最重要的抗原遞呈細胞，是唯一可以激活初始T細胞抗原遞呈細胞。人類MSC與DC共培養后，DC分泌TNF-α下降。此外，MSC可抑制DC的表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的上調，MSC還可阻止單核細胞、臍帶血細胞和CD34+造血干細胞向DC的分化成熟，這表明MSC對于不同來源的DC的成熟過程有抑制作用[6～8]。3)MSC 與自然殺傷細胞：MSC通過下調自然殺傷(NK)細胞表面NKp30、和NKG2D的表達，從而抑制靜息期NK細胞的細胞毒活性[9]。人類MSC和NK細胞共培養時，NK細胞增殖受到抑制，IFN-γ的分泌顯著減少[9，10]。關于MSC在與NK細胞共培養時是否易于被NK細胞吞噬仍存在爭議。

(2)MSC對適應性免疫的影響：1)MSC與T細胞：T淋巴細胞在受到細胞來源或非特異性的有絲分裂原刺激時細胞產生增殖反應，MSC可以抑制該增殖過程，且此過程為可逆的，TGF-β1和肝細胞生長因子可能起到重要作用。MSC可促進Th1免疫反應向Th2免疫反應轉化，其中絕大部分的體外共培養實驗結果均認為MSC可以直接抑制CD3+CD4+T細胞增殖以及Th1細胞因子(如IL-2和IFN-γ)的分泌。還有學者認為T細胞在MSC存在的情況下因為MSC表面不表達共刺激分子作為第2信號而變為免疫無能，當然這還有待于進一步確定[11]。有些研究顯示MSC對具有細胞毒性的T細胞有直接抑制作用。在細胞毒性T細胞的啟動階段，MSC可以阻止外來抗原特異性CD8+T細胞對靶細胞的細胞毒性作用[12]。2)MSC抑制B細胞：MSC抑制體外B細胞的增殖，并可以刺激B細胞分泌抗體，誘導B細胞多克隆分化和增殖，且與其間質細胞的支持作用相符[13]。

3.組織修復和再生：MSC有相當的可塑性，不僅可以分化成中胚層細胞，還可以分化為外胚層組織(神經細胞)和內胚層組織(肝細胞)。MSC已經被證實可以提高心肌功能、腦缺血后的腦功能修復肝臟和關節損傷等[14～16]。因為使用胚胎干細胞會引起很多倫理問題，所以現在許多臨床研究更傾向于使用成體干細胞比如MSC。

二、影響MSC增殖及治療效果的因素

但因MSC在成人組織中數量較少，需在體外培養達到一定的細胞數量才能起到治療的作用，所以首先找到最優的MSC體外增殖的方法是非常必要的。目前發現MSC捐獻者的年齡、性別、接種密度都可能影響細胞的數量、治療效果。但是不同的文獻報道各不相同。

(1)捐獻者年齡和MSC增殖：關于捐獻者年齡和MSC增殖的關系，相悖的研究結果和文獻都有出現。多數文獻報道捐獻者年齡和MSC增殖速率呈反比關系。其余則認為兩者無相關。Khan在研究兩組不同年齡(平均年齡分別為57歲和86歲)被試的滑膜脂肪墊來源的MSC時發現在MSC培養的多個時間點，MSC的增殖差異無統計學意義。這種趨勢也在其他許多文獻研究中被證實。但是Baxter等報道了相對于0～18歲的患者，59～75歲患者的MSC生長能力嚴重受損，表現為明顯緩慢的生長速度。

(2)捐獻者性別和MSC增殖：關于捐獻者性別和MSC增殖關系的文獻較少，因為大部分文獻的分組同時包括男性和女性來源的MSC。Faustini等在研究脂肪來源的干細胞時發現對于男性來源的干細胞來說，最有效的消化是用0.2%膠原酶孵育1h，而對女性來源的干細胞則是過夜消化法更有效。女性捐獻者的干細胞增殖數量顯著高于男性。而且考慮到干細胞還有雌激素和雄激素受體，推測MSC的增殖很可能存在性別差異。

(3)接種密度對MSC增殖的影響:盡管有限，這部分文獻仍然認為接種密度影響MSC增殖速率。Both等發現以低密度接種的MSC增殖速度更快，當MSC以100/cm2密度接種達到目標細胞數的時間比以5000/cm2密度接種快4.1天。Lode等也得到了同樣的結果，接種密度最高的細胞生長速率最小，而接種密度最小的細胞生長速率最高。高接種密度時細胞生長速率降低可能是因為細胞接觸抑制。而低接種密度時細胞高速的生長可能是因為小顆粒細胞，即停滯期的循環干細胞，該細胞可在指數生長期的對數階段大量增殖。

三、MSC的臨床應用

1.MSC在心血管系統的應用：根據WHO研究結果，心血管疾病是全球首位死亡原因。臨床前期的證實MSC可以提高嚙齒動物和豬心肌梗死后的心臟功能。MSC優先歸巢至梗死的心肌處非常重要。由于心肌梗死，增加了局部血管通透性，提高了趨化因子的釋放，上調黏附蛋白的表達，這些都有助于MSC的遷移。因此，MSC可以通過靜脈注射的途徑使用，從而避免了風險更高的輸注方式。設有安慰劑對照組的Ⅰ期臨床試驗研究(Osiris Therapeutics Inc. 網址:www.osiristx.com)結果顯示，來源于與患者人白細胞抗原不匹配的健康人的MSC，經靜脈注入患有心肌梗死的患者體內，與對照組相比，MSC能明顯提高心肌梗死患者的心臟射血分數和肺功能，而且發生心率失常的概率更小。

2.MSC在移植物抗宿主病中的應用：移植物抗宿主病(GVHD)是造血干細胞移植和供者淋巴細胞輸注后的常見并發癥，近年來對其發病機制的探索已取得很大的進步。GVHD第1線的治療是腎上腺糖皮質激素，其對50%～80%的患者有效，療效取決于起始發病時患者的嚴重程度。GVHD二線治療主要是免疫抑制劑，使用免疫抑制劑的1年生存率約為30%。而近期的研究發現MSC移植可改善GVHD患者的生存，如MSC移植可以延長異基因皮膚移植物的存活時間。Weng進行了1項對19名因患有血液系統惡性疾病行造血干細胞移植的患者進行了為期3年零5個月的隨訪，結果發現MSC的治療可以減少慢性難治性GVHD的免疫抑制劑，部分患者甚至可以停用免疫抑制劑。LeBlanc觀察到MSC對1個骨髓移植后4期GVHD有治療作用。MSC支持移植物的機制尚不清楚，可能和它們在造血微環境中的支持作用相關。MSC可以改變DC作為GVHD的中介物的作用。MSC可以阻止單核細胞和骨髓前體細胞分化為DC，在DC成熟過程中抑制CD1a、CD40、CD80、CD86和HLA-DR的上調，而Sbano等則認為MSC仍存在一定免疫原性，其治療GVHD的安全性有待于更多研究的進一步證實[17,18]。

3.MSC在系統性紅斑狼瘡中的應用：MSC可以逆轉系統性紅斑狼瘡(SLE)小鼠和患者的多器官衰竭或狼瘡腎炎，這可能與MSC提高了Treg細胞的比例有關[19,20]。也有報道稱，在兩個有活動性但炎癥表現不明顯的狼瘡患者身上，輸注自身MSC可以明顯提高Treg細胞比例卻無狼瘡癥狀的緩解[21]。還有研究者認為MSC治療SLE的機制與恢復Th1/Th2平衡有關，實驗數據表明MSC可能通過調節效應T細胞分泌IL-4和IFN-γ的水平促進SLE小鼠中優勢的Th2體液免疫反應向Th1細胞免疫反應方向轉變。如Zhou等發現向狼瘡小鼠腹腔注射骨髓來源的間充質干細胞可以抑制外周血T細胞IL-4的分泌、增加IFN-γ的分泌。這個理論在SLE患者身上也得到了證實，研究證實MSC促使免疫反應向Th1方向的極化伴隨著患者臨床癥狀的緩解[22]。但是也有實驗得到了相反的結果[23]。這些各有分歧的實驗結果表明MSC中介的效應和SLE免疫發病機制的復雜性，還需要我們進一步研究。

4.MSC在哮喘中的應用：哮喘是一類多種免疫細胞(嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等)參與的氣道疾病，因此MSC作為一種免疫調節性的細胞被多次研究用于治療哮喘。Nemeth等[24]用MSC治療豚鼠草致敏的小鼠哮喘模型發現，在激發階段在小鼠體內注入MSC可以避免小鼠出現哮喘特征性的病理改變包括嗜酸性粒細胞的浸潤、肺內過量的黏液分泌、肺泡灌洗液IL-4、IL-5和IL-13和血清IgG1、IgE的升高，究其機制，可能是IL-4和或IL-13激活了MSC的STAT6通路，導致TGF-β的分泌增高，同時還有可能聯合Treg細胞導致免疫的抑制。在一項對職業性哮喘的研究中， Martínez-González等[25]發現，人脂肪來源的MSC可以減輕哮喘職業哮喘模型早期的中性粒細胞介導的炎性反應、IgE分泌、抑制淋巴細胞浸潤而保護肺泡結構、明顯抑制肺泡平滑肌細胞的肥大和增生和氣道高反應性。

近年來多項研究均表明MSC的免疫調節能力在多種疾病中起到治療作用，是新型的臨床治療手段。但相悖的研究結果也時有出現，而這些不同的研究結果可能跟各不相同的研究對象、試劑和實驗條件有關。所以明確MSC在人群各種免疫失調性疾病中是否有治愈作用有重要意義。未來的研究重點應是在確保患者安全的前提下盡可能開展多中心臨床試驗，在確定MSC治療作用的基礎上研究其治療機制。

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(修回日期：2014-12-17)

國家自然科學基金面上項目(81270073)

200433 上海 第二軍醫大學附屬長海醫院呼吸內科

白沖,電子信箱：bc7878@sohu.com

R593

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.003

2014-12-04)