反相高效液相色譜法測定血液中去甲萬古霉素濃度的研究

李順煒，袁孔現，朱 虹，詹三華

(銅陵市人民醫院藥劑科，安徽銅陵 244000)

反相高效液相色譜法(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)是由非極性固定相和極性流動相組成的液相色譜體系［1］，十八烷基鍵合硅膠為典型固定相，甲醇和乙腈則為典型流動相。RP-HPLC作為液相色譜的主要分離模式，幾乎可分離測定所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物。

去甲萬古霉素(Norvancomycin)為糖肽類抗感染藥物，為快效殺菌劑，抑制細菌細胞壁糖肽聚合物的合成，進而妨礙細胞壁的形成。臨床上主要用于重癥感染患者的治療，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌等有較強的抗菌作用［2］。由于其抗感染治療作用顯著，存在不合理使用的可能，需要加強對該類藥物的使用監管［3］。因其具有明確的耳、腎毒性［4］，使用時除需嚴格控制適應證外，用藥劑量亦需個體化設計［5］，有條件的要進行藥物濃度監測(TDM)。本文通過查閱文獻［6－8］，并根據現有條件，建立了一種快速測定去甲萬古霉素血藥濃度的方法，血液取樣量少，操作簡單、快速，靈敏度和準確度較高，適用于臨床進行藥物濃度監測和個體化給藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AD系列高效液相色譜儀，包括LC-20AD輸液泵、SPD-20AV型 UV/VIS檢測器，CTO-20A型柱溫箱、LC solution色譜工作站和CBM-20Alite系統控制器(日本島津制作所)。SIGMA高速離心機和MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋電機生物醫學有限公司)。

1.2 試藥 去甲萬古霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號130338－200303)，替硝唑對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100336－200402)、甲硝唑對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號0191－9804)。甲醇(色譜純，美國 Tedia公司，批號001916)、乙腈(色譜純，美國 Tedia公司，批號1108469)。特級新生牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號20100310)。高氯酸、磷酸、磷酸二氫鉀、尿素為分析純。純化水為本實驗室自制亞沸蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜分析使用Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動相組成為甲醇—乙腈—40 mmol·L－1KH2PO4緩沖液(含 0.1% 磷酸)=15∶5∶80(v/v)，進樣量為 20 μL，流速為 1.0 mL·min－1，柱溫35℃，紫外檢測波長236 nm。靈敏度AUFs=0.02，以峰面積、內標法定量。

2.2 流動相和過渡相的配制 精密稱取KH2PO4(分析純)5.44 g，加入1 000 mL 純化水、1.0 mL 磷酸混勻，配制成40 mmol·L－1KH2PO4溶液。取800 mL KH2PO4溶液，與150 mL甲醇(色譜純)、50 mL乙腈(色譜純)混勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，脫氣5 min，即配制成流動相。過渡相使用甲醇－純化水(20∶80，v/v)。

2.3 標準溶液、沉淀劑及助溶劑的配制 將去甲萬古霉素標準品和替硝唑標準品置于105℃烘箱中干燥2 h。精密稱取100.0 mg去甲萬古霉素標準品，以2%尿素溶液定容至100 mL并搖勻，配制成1 000.0 mg·L－1標準貯備液。精密稱取 20.0 mg替硝唑標準品，以純化水定容至100 mL搖勻，配制成200 mg·L－1內標液。取15 mL高氯酸加純化水至100 mL，配制成15%高氯酸溶液作為沉淀劑。稱取20 g尿素加純化水至100 mL，配制成20%尿素溶液作為助溶劑。以上所有配制溶液均放置于4℃冰箱中保存備用。

2.4 血樣處理 取血清200μL，加入內標液20μL后渦旋混勻，再加入20%尿素溶液和沉淀劑各100 μL，渦旋混勻1 min后，經14 800 rpm高速離心8 min，取上清液20μL進樣，記錄色譜圖，見圖1。

2.5 標準曲線繪制 取去甲萬古霉素標準儲備液，用2%尿素溶液分別稀釋成濃度為20.0、40.0、80.0、160.0、320.0、640.0 mg·L－1標準溶液備用。取新生牛血清200μL置于離心管中，分別加入上述不同濃度標準溶液各50μL，混勻，使其濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg·L－1。按“2.4”項下操作，以替硝唑為內標，每一濃度平行3份，以樣品的峰面積計算其實際測算值。計算結果取平均值(Y)對去甲萬古霉素理論濃度(X)作線性回歸，得回歸方程為 Y=0.963 1X+0.068 2，r=0.996 8(n=6)。以信噪比(S/N)≥3計算最低檢測限為 2.5 mg·L－1。

2.6 回收率與精密度 制備去甲萬古霉素濃度分別為 5.0、20.0、80.0 mg·L－1的血清樣品，照“2.4”項下操作，每種濃度一天內分別進樣5次，用標準曲線方程帶入所測得樣品峰面積，計算血清濃度，用實測濃度和樣品濃度的比值表示方法回收率，計算RSD，得日內差異。每日測定1次，連續測定5 d，計算RSD，得日間差異，結果見表1。

表1 回收率和精密度實驗結果(n=5)

2.7 穩定性考察 配制含去甲萬古霉素5.0、20.0、80.0 mg·L－1三種濃度血清質控樣品，分別在室溫下放置4 h，在－40℃凍融 1次、2次，以及－40℃冷凍1周、1個月的條件下，按“2.4”項下操作，每一濃度平行5次，計算各種條件下的實測值和RSD，考察其穩定性。考察結果RSD＜10%，證明該方法完全符合去甲萬古霉素常規血藥濃度監測的要求，結果見表2。

表2 穩定性考察(n=5)

2.8 干擾試驗 考慮臨床普遍存在合并用藥的實際情況，試驗考察了常用的頭孢哌酮、阿奇霉素、左氧氟沙星等抗感染藥物，抗真菌藥氟康唑以及潑尼松、甲潑尼龍、地塞米松等激素類藥物對去甲萬古霉素色譜行為的影響，均未發現上述藥物對樣品色譜峰有明顯干擾，滿足常規血藥濃度監測要求。

2.9 臨床應用 隨機抽取我院已持續規范使用去甲萬古霉素至少3 d的在院患者，分別于用藥前和用藥后10 min內各抽樣一次，以用藥前血樣為谷濃度樣本，用藥后10 min內血樣為峰濃度樣本［9］，按“2.4”項下操作，測得去甲萬古霉素濃度結果見表3，所測結果符合臨床實際。

表3 患者去甲萬古霉素血藥濃度監測結果

3 討論

本實驗過程中在使用流動相前后用過渡相低壓灌注以防止流動相中的KH2PO4在回路和色譜柱中析出。

尿素對去甲萬古霉素有助溶作用。使用2%尿素水溶液溶解去甲萬古霉素保證標準溶液穩定，血樣處理時加入20%尿素助溶可以提高萬古霉素的響應值。

［6］，含去甲萬古霉素的血樣處理都用沉淀蛋白——離心法，所用沉淀劑有硫酸鋅、高氯酸［7－8］，本試驗采用15%高氯酸作為沉淀劑，加入助溶劑后高速離心，抽取上清液進樣。使用15%高氯酸可以充分沉淀血清中蛋白質，滿足實驗要求。

文獻報道［6－7］使用萬古霉素和去甲萬古霉素互為內標檢測兩者濃度，在實驗過程中我們發現這兩者出峰位置較近，難以嚴格區分，且藥品去甲萬古霉素中一般都含有少量萬古霉素［10］，使用萬古霉素作為內標檢測去甲萬古霉素血藥濃度容易出現較大誤差。本實驗內標物替硝唑，與受試藥物去甲萬古霉素可完全分離，兩者完全無干擾。考慮到上述兩藥合并使用的可能性，檢測去甲萬古霉素血藥濃度時必須明確患者是否同時使用替硝唑，否則測定結果會出現較大偏差。在患者并用去甲萬古霉素和替硝唑的前提下，可換用甲硝唑代替替硝唑為內標物。試驗證明去甲萬古霉素與甲硝唑、替硝唑三者分離良好，均無干擾。

去甲萬古霉素有效血藥濃度谷、峰值參照萬古霉素有效血藥濃度谷、峰值設定［11］。為確保去甲萬古霉素抗感染治療的有效性和安全性，避免產生不良反應，尤其是耳、腎毒性的發生與去甲萬古霉素的血藥濃度過高密切相關，臨床應用時可依據監測血藥濃度并及時調整用藥劑量以避免器官損害風險。特別是對于長期使用的患者、出生低體重兒、新生兒和幼兒，與可引起腎臟及聽力損害的藥物(如慶大霉素、鏈霉素、兩性霉素B)［12］聯用的患者。

去甲萬古霉素抗菌活性近似于萬古霉素，合適的血藥濃度對于敏感細菌有較好的抑制、殺滅作用，可替代萬古霉素用于當其他藥物如青霉素或患者不能耐受的嚴重葡萄球菌或其他革蘭陽性菌感染，特別是用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染。去甲萬古霉素長期使用時峰濃度不宜超過 30～40 mg·L－1，谷濃度需要 10～15 mg·L－1，治療低敏感性MRSA感染時谷濃度可保持 15 ～20 mg·L－1［13］。去甲萬古霉素存在一定程度的暴露－耳、腎毒性，當用藥后出現血清肌酐升高可定義為腎臟毒性，由于密集用藥會增加腎臟毒性，為治療MRSA感染而使用高劑量去甲萬古霉素時需格外關注;使用去甲萬古霉素時需作聽力監測，特別是高危患者，出現耳鳴時應立即停用去甲萬古霉素。

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