淫羊藿苷對體外在無地塞米松培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)大鼠骨髓基質細胞成骨性分化的影響

馬小妮，石文貴，謝艷芳，馬慧萍，甄 平，陳克明

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，甘肅蘭州 730050)

隨著我國人口日趨老齡化，骨質疏松癥的發(fā)病率迅速升高。該病主要是由于骨吸收大于骨形成，從而導致骨丟失的一種嚴重威脅中老年人健康的常見?。?-3］。自從Yang等［4］報道了運用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)治療骨質疏松會增加心血管疾病和乳腺癌的發(fā)病率，很多學者紛紛轉向尋找其它治療骨質疏松的天然療法。近年來，一些研究顯示，淫羊藿苷具有促進骨髓基質細胞骨形成活性和抑制破骨細胞骨吸收活性［5］。不過，上述研究是在傳統(tǒng)的成骨分化誘導劑存在的條件下得出淫羊藿苷具有促進骨髓基質細胞骨形成活性的結論。傳統(tǒng)的成骨分化誘導劑的配方為:1× 10-8mol·L-1地塞米松(dexamethasone)、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate)和 50 g·L-1磷酸化維生素 C(L-ascorbic acid-2-phosphate)［6］。其中，β-甘油磷酸鈉和磷酸化維生素 C主要促進大鼠骨髓基質細胞的礦化［7-8］，地塞米松對大鼠骨髓基質細胞的分化有重要作用［9］。本實驗主要觀察在無成骨分化誘導劑(地塞米松)時淫羊藿苷對大鼠骨髓基質細胞成骨性分化的影響，以期尋找一種新的或更強的促體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質細胞成骨性分化的誘導劑。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)液(Gibco)，無酚紅DMEM培養(yǎng)液(Gibco)，標準胎牛血清(蘭州民海生物公司)，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、地塞米松(Sigma)，活性炭處理的胎牛血清(CSFBS，Biowest)，淫羊藿苷(中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%)，RNA提取試劑(RNAiso Reagent)、反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMreagent Kit)、RT-PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)(大連寶生物公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司)，CCK-8試劑盒(上海同仁化學研究所東仁化學科技有限公司)，鈣鹽沉積量檢測試劑盒(BioVision)，骨鈣素含量測定試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 大鼠骨髓基質細胞的培養(yǎng) 大鼠骨髓基質細胞培養(yǎng)方法如下:將Wistar雄鼠脫頸處死，無菌條件下剝離出股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，用12號針頭從一側切口向骨髓腔內注入DMEM/F12培養(yǎng)液，充分沖出骨髓，用滴管反復吹打，使細胞均勻分布。用150目的濾網過濾，所得的細胞懸液置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄培養(yǎng)液，用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌2遍，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3 d換液1次，待細胞鋪滿皿底80%以上時，進行后續(xù)實驗。

1.3 ALP活性測定 將第一代(P1)細胞以每毫克1×105個接種于60 mm培養(yǎng)皿，用含10% 活性炭處理的胎牛血清(CSFBS)的無酚紅培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d換液一次，待細胞融合成片時加入1×10-8mol·L-1的地塞米松(作為陽性對照組)或1×10-5mol·L-1的淫羊藿苷培養(yǎng)3、6、9、12 d?；九囵B(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照組。按ALP試劑盒說明書操作測定3、6、9、12 d的 ALP活性，酶活力以金氏單位/100 μL 表示［10］。

1.4 茜素紅組織化學染色 同1.3項方法處理細胞至12 d，進行茜素紅染色。具體方法如下:棄培養(yǎng)液，PBS 洗細胞2 次，加入 pH=8.9、0.1%的茜素紅染色液，每皿3 mL，37°C水浴1 h，顯微鏡下照相觀察結果并采用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描茜素紅染色區(qū)域的面積及IOD，按培養(yǎng)皿的面積×(鈣化結節(jié)染色區(qū)域掃描面積/照片中培養(yǎng)皿的掃描面積)公式計算茜素紅染色區(qū)域的面積。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖 第一代(P1)骨髓基質細胞以每孔3×103個/100 μL接種96孔板，24 h后分別用含有1×10-8mol·L-1地塞米松或1×10-5mol·L-1淫羊藿苷的無酚紅DMEM+10%CSFBS 培養(yǎng)液培養(yǎng) 0、3、6、9、12 d，每 3 d 更換一次培養(yǎng)液，基本培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為陰性對照，按照CCK-8試劑盒說明書處理上述細胞，于酶標儀上測定450 nm處的吸光度(OD)值。

1.6 RT-PCR檢測骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因表達同1.3項下方法分別處理細胞 12、24、36、48 h后，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS漂洗2次。加入1 mL Trizol裂解細胞并收集裂解液，加入200 μL氯仿混勻后室溫放置5 min，4℃ 12 000 rpm·min-1離心15 min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置15 min，4℃ 1 2 000 rpm·min-1離心 10 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4℃ 12 000 rpm·min-1離心5 min。棄上清，加入40 μL無 RNA酶ddH2O重懸沉淀，-80℃保存?zhèn)溆?逆轉錄反應制備互補 DNA(cDNA)，按照 TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit說明書合成 cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?PCR擴增cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMII說明書添加PCR反應體系，進行40個循環(huán)擴增目的基因，RT-PCR數據處理采用2-△△Ct法，合成的引物(大連寶生物公司合成)序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 篩選地塞米松最有效作用濃度 通過測定ALP活性篩選出地塞米松最有效作用濃度，結果顯示，1×10-8mol·L-1地塞米松處理骨髓基質細胞時，ALP活性極顯著地高于對照組和其它各濃度組(P ＜0.01)(圖1)，表明 1 ×10-8mol·L-1是地塞米松的最有效作用濃度。

2.2 骨髓基質細胞增殖分析結果 CCK-8檢測結果顯示，在培養(yǎng)的3、6、9、12 d，對照組、地塞米松組和淫羊藿苷組、細胞的增殖活力之間無顯著差異見圖2。

2.3 淫羊藿苷顯著地提高骨髓基質細胞ALP活性 如圖3所示:在淫羊藿苷處理的第3天，淫羊藿苷組和陽性對照(PC)組ALP活性顯著地高于對照組。第6天和第12天，淫羊藿苷組ALP活性顯著地高于對照組和PC組(與對照組相比:P＜0.01，與PC組相比，P＜0.05)。第9天，淫羊藿苷組ALP活性極顯著地高于對照組和PC組(P＜0.01)。上述結果表明，淫羊藿苷能在無地塞米松的培養(yǎng)基中提高骨髓基質細胞ALP活性。

2.4 淫羊藿苷顯著地增加骨髓基質細胞鈣化結節(jié)染色 如圖4所示:在淫羊藿苷處理12 d，淫羊藿苷組茜素紅染鈣化結節(jié)的數目(染色斑點)及鈣化結節(jié)染色區(qū)域的面積均明顯地多于對照組和PC組。上述結果表明，淫羊藿苷在無地塞米松的培養(yǎng)基中促進骨髓基質細胞的礦化。

2.5 RT-PCR分析結果 如圖5A所示，淫羊藿苷組BMP mRNA的表達在藥物處理24 h時達到峰值，此后呈下降趨勢，且在藥物處理12、24 h顯著地高于對照組(P ＜0.01);如圖5B 所示，在藥物處理12、24、36、48 h，淫羊藿苷組OPG mRNA的表達均顯著地高于對照組(P＜0.01);RANKL的表達在各時間點均與對照組無顯著性差異(數據未顯示);如圖5C所示，OPG/RANKL的變化趨勢與OPG mRNA的表達相似，即在藥物處理12、24、36、48 h時，淫羊藿苷組OPG 與RANKL的比值顯著地高于對照組(均P＜0.01)。

3 討論

現(xiàn)有研究顯示，在成骨分化誘導劑(地塞米松)存在時，淫羊藿苷具有促進骨髓基質細胞分化的作用［10］。然而，相關的研究表明地塞米松并不是一個通用的促成骨細胞分化及礦化的誘導劑，例如，它能促進人骨髓基質細胞增殖，卻抑制小鼠成骨細胞增殖，而且地塞米松不能夠刺激人膠原的生成［11］。上述地塞米松對不同種屬相關成骨基因的不同作用，致使將它作為成骨細胞分化及礦化的誘導劑在使用上受到一定程度的限制。另一方面，地塞米松作為一種糖皮質激素可能會引起骨質疏松的發(fā)病［12］。因此，尋找一種新的促大鼠骨髓基質細胞成骨性分化的誘導劑至關重要。于是，我們猜想在無地塞米松時，淫羊藿苷是否可以作為一種新的促體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化的誘導劑。因此本研究主要探討了在沒有成骨分化誘導劑(地塞米松)存在時淫羊藿苷對體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化的影響。首先，我們篩選出地塞米松最有效作用濃度(1×10-8mol·L-1)，而淫羊藿苷的最有效作用濃度是根據本課題組陳克明的文章［13］。本研究結果顯示，淫羊藿苷在無地塞米松的培養(yǎng)基中能明顯地促進體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化，具體表現(xiàn)在淫羊藿苷能明顯地提高ALP活性、OPG mRNA表達及 OPG與RANKL的比值。而 OPG/RANKL的比值反映骨吸收的強弱，比值降低則骨吸收增強，比值升高，則骨吸收降低［14］，由此可以說明淫羊藿苷還可以通過抑制骨吸收從而促進骨形成。Li等［15］研究報道淫羊藿苷以BMP依賴的方式促進小鼠成骨細胞分化及礦化，我們的結果也顯示了淫羊藿苷能夠提高骨髓基質細胞BMP mRNA表達。Ming等［5］報道淫羊藿苷是一種植物雌激素，盡管HRT治療骨質疏松會增加心血管疾病和乳腺癌的發(fā)病率，但到目前為止，還沒有文獻報道淫羊藿苷對骨質疏松的治療有明顯的副作用。本研究將會在后續(xù)體內實驗中進一步探討淫羊藿苷藥理學作用。

雖然本研究結果顯示了淫羊藿苷在無地塞米松的培養(yǎng)基中能明顯地促進骨髓基質細胞成骨性分化，但具體的作用機制目前仍不十分明了。Zhai等［13］的研究報道淫羊藿苷通過BMP及一氧化氮(NO)信號途徑促進成骨細胞分化及礦化，類似地，Li等［15］報道了淫羊藿苷通過上調成骨轉錄因子(Runx-2)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)表達促進成骨細胞分化及礦化。而我們的研究提示淫羊藿苷第八位碳原子上的異戊烯基在其促進體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化上發(fā)揮作用［16］。

總之，本研究從細胞水平上觀察了在無地塞米松時淫羊藿苷對體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化的影響，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷具有顯著的促體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化的能力，提示其有可能成為一種新的、更強的促體外培養(yǎng)骨髓基質細胞成骨性分化的誘導劑，為骨質疏松治療提供新藥物和新療法。

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