氣相色譜法測定替諾福韋酯中有機(jī)溶劑殘留量

劉 燕，王 輝，張 偉，丁小娟，呂 凌

(1.安徽食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051;2.安徽貝克聯(lián)合制藥有限公司，安徽太和 236604;3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230031)

核苷類藥物廣泛用于乙型肝炎的治療，如拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋等，但乙肝病毒隨著核苷類抗病毒藥物的應(yīng)用，其耐藥性問題也漸漸突顯出來。富馬酸替諾福韋作為一種新型核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，美國FDA于2001年批準(zhǔn)用于治療艾滋病治療后，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其能有效抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制，2008年后替諾福韋相繼被美國和歐洲批準(zhǔn)用于治療成人慢性乙型肝炎的治療，成為第五個(gè)治療乙肝病毒的核苷類似物［1-4］。根據(jù)其合成工藝路線，替諾福韋中可能殘留的有機(jī)溶劑有N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈、乙醇、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯、異丙醇、氯甲基異丙基碳酸酯，由于使用的有機(jī)溶劑多數(shù)對(duì)人體有較大的危害，故為確保其治療效果，降低毒副作用，對(duì)其在合成過程中所使用的有機(jī)溶劑的殘留進(jìn)行檢測。

1 儀器與試劑

島津GC-14C氣相色譜儀，N2000色譜工作站。乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜條件:色譜柱為VF-17ms毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25(m)，F(xiàn)ID檢測器，進(jìn)樣口溫度150℃，檢測器溫度250℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫:初始30℃，保持6 min，每分鐘40℃升至220℃，保持8 min。進(jìn)樣體積為 1 μL，載氣為高純氮?dú)?99.99%。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):取混合對(duì)照品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。測得乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮理論塔板數(shù)分別為:15 410、5 886、16 815、21 548、4 035、45 609、283 424、291 096。乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮的分離度均大于1.5。

空白溶劑測定:取二甲亞砜，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。

2.2 溶液配制 對(duì)照品溶液配制:精密稱取乙醇0.50 g、異丙醇 0.50 g、二氯甲烷 0.06 g、乙腈 0.041 g、乙酸乙酯 0.50 g、N，N-二甲基甲酰胺 0.088 g、氯甲基異丙基碳酸酯0.50 g、N-甲基吡咯烷酮0.053 g，置同一50 mL的量瓶中，加二甲亞砜適量充分振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液，精密量取混合對(duì)照品貯備液5 mL，置50 mL的量瓶中，用二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密稱取本品適量，用適量二甲亞砜溶解并稀釋成每1 mL中約含0.2 g的溶液，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取乙醇0.499 5 g、異丙醇0.503 9 g、二氯甲烷0.057 2 g、乙腈 0.042 9 g、乙酸乙酯 0.500 0 g、N，N-二甲基甲酰胺0.089 3 g、氯甲基異丙基碳酸酯0.495 1 g、N-甲基吡咯烷酮0.048 6 g，置同一10 mL的量瓶中，加適量二甲亞砜振搖溶解后稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液，精密量取混合對(duì)照品貯備液，用二甲亞砜稀釋成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以各峰的峰面積(A)對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

(2)精密度實(shí)驗(yàn):精密取混合對(duì)照品溶液1 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并計(jì)算RSD值，結(jié)果乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮的 RSD分別為 6.02%、3.62%、5.56%、9.19%、3.74%、7.94%、3.71%、6.43%，表明儀器精密度良好，方法重現(xiàn)性合格。

(3)檢測限:分別按照對(duì)照品溶液的制備方法精密稱取8種溶劑適量，不斷用二甲亞砜稀釋制成供試液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，直至信噪比(S/N)≥3，記錄色譜圖。結(jié)果乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮的檢測限分別為39.96、40.312、45.76、34.32、40、71.44、39.608、38.88 ng。

(4)加樣回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取已測定乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯、N-甲基吡咯烷酮含量的腺嘌呤衍生物9份，每份約5 g，按2.2項(xiàng)下配制供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各對(duì)照品的平均加樣回收率和RSD值，結(jié)果顯示各對(duì)照品的平均回收率為 104.55%、106.44%、106.59%、102.25%、95.78%、98.53%、99.38%、95.83%，RSD 分別為 1.35%、1.46%、2.11%、3.22%、2.17%、1.79%、2.33%、2.92%(n=9)。

2.4 樣品測定 取三批樣品，按2.2項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖3，結(jié)果顯示，樣品中測出乙酸乙酯和N-甲基吡咯烷酮兩個(gè)組分，其余6個(gè)溶劑均未檢出，見表2。

表2 有機(jī)溶劑殘留量的測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)建立了一種腺嘌呤衍生物中有機(jī)溶劑殘留的氣相色譜測定方法，該方法靈敏度高，具有較好的重現(xiàn)性，在三批樣品中檢測到乙酸乙酯和N-甲基吡咯烷酮的殘留，未檢測到乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、氯甲基異丙基碳酸酯。

4 討論

藥品中的有機(jī)溶劑殘留系指藥品原料藥、輔料以及制劑生產(chǎn)中使用的，但在工藝過程中未完全除去的有機(jī)揮發(fā)性化合物，由于這些溶劑大多對(duì)人體有害，故要嚴(yán)格控制其在藥品原輔料及其制劑中的殘留量，確保用藥的安全性和有效性。

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