人黑色素瘤中腫瘤相關巨噬細胞的檢測和臨床意義

王曉楠，宋寧靜，程興旺，李 群，陳向紅

(1.安徽醫科大學病原與免疫學實驗中心，安徽合肥 230032;2.上海國際醫學中心皮膚科，上海 200000;3.蚌埠醫學院附屬醫院急診外科，安徽蚌埠 233000;4.安徽醫科大學第一附屬醫院病理科，安徽合肥 230032)

黑素瘤是一種人皮膚常見的侵襲性強、轉移率高且預后不良的皮膚惡性腫瘤［1］。黑素瘤好發于皮膚及鄰近皮膚的黏膜組織，其發病率在皮膚惡性腫瘤中位居第三(約占6.8% ～20%)。近20年來，由于多因素的影響，本病的發病率和死亡率呈逐年遞增趨勢，年增長率約 3% ～5%［2－4］，且多數患者在初診時即處于本病的快速進展期甚至晚期，導致患者預后差，5年生存率低［5］。我國黑素瘤的發病率較低，但由于我國人口基數大，絕對發病人數也很多。手術切除對于早期黑素瘤的是非常有效的治療手段，但對于中晚期發生轉移的患者，現有的各種治療效果均不佳，患者5年生存率僅有14%［6］。雖然近年醫療發展水平有了一定的提高，但是其治療手段和方法進展尚不明顯，導致黑色素瘤患者效果仍不容樂觀［7］。深入認識皮膚黑素瘤的發生發展的分子機制，發掘其過程中重要的關鍵因子，可以為其診斷和治療提供新的生物靶點和思路。腫瘤細胞必須依賴于宿主間質細胞的支持才能夠無限增殖并形成腫瘤，這些間質成分包括維持腫瘤生長和作為日后遠處轉移途徑的血管、纖維和一些免疫細胞，它們構成了腫瘤發生發展的微環境。其中，在腫瘤的微環境中就包括了巨噬細胞。研究表明在實體腫瘤中有大量的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)浸潤，這些TAM與腫瘤的發生、發展關系密切［8－10］。為深入了解TAM在皮膚黑色素瘤發病中作用，本研究應用免疫組織化學方法檢測皮膚惡性黑素瘤和良性色素痣CD68表達來襯染TAM，然后分別進行計數，分析其與黑素瘤臨床病理特征的關系，以探討TAM在皮膚惡性黑素瘤發生發展中可能扮演的角色。

1 資料和方法

1.1 病例資料 收集安徽醫科大學第一附屬醫院74例皮膚黑素瘤和30例皮膚色素痣。所有標本均以4%甲醛固定，石蠟包埋，常規做蘇木精—伊紅(HE)染色，經組織病理學確診。所有病例以3 μm厚度連續切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預先處理的載玻片上，備用。

1.2 主要試劑 人CD68單克隆抗體，通用型兩部法免疫組織化學試劑盒及DAB顯色劑均購自中國福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學兩部法染色。將組織切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復，DAB顯色。蘇木精溶液復染，脫水，中性樹膠封片。具體操作按說明書染色步驟進行。陽性對照采用已知陽性切片，陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。

1.3.2 結果判定 TAM的評定通過光學顯微鏡下計數CD68陽性細胞完成。具體計數步驟采用Russell D Leek方法［11］:首先在低倍鏡(100倍)下選取視野中巨噬細胞最密集的三個區域(即“熱點區”)，然后在高倍鏡(400倍)下進行巨噬細胞計數，取三個數據的平均值進行統計學分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS(13.0 for window)軟件進行統計學分析。計量資料以(±s)描述，兩組間的比較采用成組t檢驗。Logistic回歸模型分析CD68陽性TAM浸潤數目的影響因素;計數資料則采用卡方檢驗(一般資料)或秩和檢驗(等級資料)，P＜0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAM在皮膚黑色素瘤和色素痣中的分布和計數 CD68陽性信號呈棕黃色顆粒，主要定位于巨噬細胞的胞漿和胞膜(圖1)。在黑色素瘤組織中有大量CD68陽性的巨噬細胞浸潤，細胞形態不一，主要分布于腫瘤的浸潤前沿和腫瘤細胞巢的間隙中，呈片狀分布;良性色素痣中CD68陽性的巨噬細胞罕見，主要分布于痣細胞的間隙中，呈零星散在分布。74例皮膚黑素瘤組織中，每個高倍視野中的巨噬細胞平均計數為15.08個，顯著高于色素痣中巨噬細胞計數3.87個，兩者差異有統計學意義(P=0.001)，見表1。

表1 人皮膚黑色素瘤和色素痣中巨噬細胞計數的比較

2.2 TAM計數與黑素瘤患者臨床病理特征的關系 將黑色素瘤中TAM計數平均值15.08設置為界點，將每例黑色素瘤TAM計數分為低級別和高級別，然后觀察TAM級別與臨床病理特征的關系。如表2所示，人黑色素瘤組織中巨噬細胞浸潤的數目與腫瘤的厚度、腫瘤浸潤深度和腫瘤淋巴結轉移呈顯著正相關(均P＜0.05);與患者年齡、性別和腫瘤分型均無顯著相關性(均P＞0.05)。

2.3 黑色素瘤CD68陽性TAM浸潤的影響因素為了探討黑色素瘤組織中CD68陽性TAM浸潤的相關影響因素，我們建立了Logistic回歸模型，將患者年齡、腫塊厚度和腫瘤浸潤深度等臨床病理參數指標一并納入回歸模型，對TAM計數進行多因素分析。研究結果顯示腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移是決定TAM計數具有統計學意義的影響因子(P=0.001和0.016)。

表2 人黑色素瘤TAM計數與患者臨床病理特征的關系

3 討論

目前TAM在腫瘤中發揮作用已經逐漸得到認可［12］，但在不同腫瘤中發揮的作用和機制目前尚不明朗，甚至出現了矛盾的研究報道。傳統理論認為，單核/巨噬細胞作為機體主要抗原呈遞細胞，是參與特異性和非特異性抗腫瘤免疫的第一防線細胞。巨噬細胞在抗腫瘤免疫中的作用不僅是作為抗原呈遞細胞，而且是溶解腫瘤細胞的效應細胞。臨床病理研究資料表明，腫瘤組織周圍若有明顯的巨噬細胞浸潤，腫瘤擴散轉移的發生率較低，預后也較好;反之，腫瘤擴散轉移率高，預后較差［13］。郭英軍等［14］研究發現:在真皮淺層尤其是接近真表皮交界處，單核/巨噬細胞形成了數層較致密的細胞網，這些細胞在真皮內具有明確的方向性，可有效防御侵入真皮的入侵物。而且，活化的單核巨噬細胞還通過分泌某些細胞因子，如:IL-10、IL-12等，參與調節機體抗腫瘤免疫的不同時相，其中IL-12是一種新型促炎癥細胞因子，研究發現，其對多種實體腫瘤尤其是黑色素瘤和腎細胞腫瘤既能直接消滅［15］，又能間接抑制腫瘤周圍的血管生成［16－18］。這些研究表明，黑色素瘤中的巨噬細胞，即TAM是參與抗黑色素瘤免疫和侵襲轉移的重要防御細胞。另一方面，研究發現黑色素瘤與TAM間存在共生關系，甚至TAM促進黑色素瘤細胞的生存，如:黑素瘤細胞通過分泌趨化因子吸引TAM并維持其生存，受黑素瘤組織中微環境因子如組織缺氧(低氧壓)的影響，TAM通過產生促進腫瘤血管生成的重要有絲分裂原及各種生長因子和酶類而有助于黑素瘤細胞的生長和轉移［19］;在臨床黑色素瘤組織中，浸潤的巨噬細胞數量指數、血管分級程度、黑素瘤惡性程度三者正相關［20］。這些研究結果提示:TAM可能參與并促進了黑色素瘤的發生和發展，是一類促癌細胞。我們在觀察人皮膚黑素瘤的病理切片時，也經常會發現:在大多數黑素瘤的瘤體中有一定量的巨噬細胞存在，這些所謂的TAM主要出現在腫瘤細胞的間隙和腫瘤浸潤的前沿，其數目不一，有時甚至可以超過腫瘤細胞總數的50%。而在良性的皮膚色素痣中，通常沒有這些巨噬細胞的浸潤，即使在合并感染的情況下，在痣細胞巢周圍浸潤的炎性細胞主要為中性白細胞或淋巴細胞，而沒有TAM浸潤。通過臨床發現的在黑素瘤和色素痣病例中存在的這些規律性現象，提示了巨噬細胞在黑素瘤的發病過程中可能發揮了一定的作用，并且腫瘤細胞和這些TAM之間必定存在著一些“通訊”和“反饋”來調控黑素瘤的發病和生長侵襲。

本研究通過免疫組化CD68染色標記組織中浸潤的巨噬細胞，然后進行計數和統計學分析，結果顯示:黑色素瘤組織中巨噬細胞個數顯著高于良性色素痣，提示TAM可能在黑色素瘤發生過程中發揮了一定作用。進一步分析發現，TAM個數與黑色素瘤的腫瘤厚度、腫瘤浸潤深度和腫瘤淋巴結轉移呈正相關，提示TAM可能在黑色素瘤惡性進展過程中發揮了作用。并且我們的結果顯示TAM對黑色素瘤的發生發展發揮了促進作用，而非抑制作用，與文獻報道一致［9］。有研究顯示:TAM在腫瘤微環境中通過分泌血管生成因子來促進腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和侵襲提供營養和通道，并且能夠抑制機體內抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤細胞逃逸免疫殺傷，最終促進病情進展［21－22］。

綜上所述，本研究通過比較人皮膚黑色素瘤和色素痣中巨噬細胞的計數及其與腫瘤臨床病理特征的關系，發現黑色素瘤中TAM顯著增高，并且與腫瘤進展密切相關，提示TAM在人體皮膚黑素瘤中的發生發展發揮了一定重要的促進作用，可能是黑素瘤預后差和治療效果不佳的一個重要因素。

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