大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內皮依賴性舒張功能以及親環素A表達的變化

盛沖霄，黎紅華，劉康，馮海松

大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內皮依賴性舒張功能以及親環素A表達的變化

盛沖霄，黎紅華，劉康，馮海松

目的：觀察高脂飲食喂養大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內皮依賴性舒張功能的改變以及親環素A（CyPA）的表達變化。

方法：雄性Wistar大鼠30只隨機分為4組，對照組（6只），動脈粥樣硬化8周組（AS 8W組）8只，動脈粥樣硬化12周組（AS 12W組）8只，動脈粥樣硬化15周組（AS 15W組）8只。給予動脈粥樣硬化組高脂飼料喂養，并給予維生素D3注射液60萬IU/kg一次性腹腔注射，對照組給予基礎飼料喂養。同期處死大鼠，分離腹主動脈，行蘇木素伊紅（HE）染色，免疫組化法檢測動脈壁CyPA的表達。另外截取約5 mm新鮮大鼠腹主動脈環，在離體器官浴槽中觀察離體腹主動脈環對乙酰膽堿舒張反應。

結果：隨著造模時間的進展，各組大鼠分別呈現出了血管正常結構、內皮細胞破壞，平滑肌細胞增生、粥樣斑塊形成以及鈣化斑塊形成等不同的病變特征。內皮依賴性舒張功能進行性下降，對照組、AS 8W組、AS 12W組、AS 15W組最大舒張度分別為（93.46±2.80）%、（82.58±3.25）%、（61.19±3.72）%、（41.28±2.68）%，各組間差異均有統計學意義（P均＜0.05）。血管內皮細胞以及平滑肌細胞CyPA的表達不斷增加，四組大鼠CyPA平均光密度測定分別為0.25±0.06、 0.34±0.09、0.53±0.09、0.68±0.13，各組間比較差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

結論： CyPA的表達隨著病變進展不斷增加，內皮依賴血管舒張功能進行性下降。CyPA的表達與動脈粥樣硬化病變嚴重程度有關。CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一。

動脈粥樣硬化；親環素A ；內皮依賴性舒張功能

Methods: A total of 30 male Wistar rats were divided into 4 groups: Control group, the rats received normal diet, and 3 atherosclerosis groups, the rats received high cholesterol diet for different period of time and a single dose intraperitoneal injection of Vitamin D3 at 600,000 IU/kg, as Atherosclerosis at 8 weeks (AS 8W) group, AS 12W group and AS 15W group, n=8 in each AS group. The rats were sacrificed at the same time to isolate aorta abdominalis. The expression of CyPA at the wall of aorta abdominalis was detected by HE staining and immunohistochemistry. In addition, the aorta abdominalises was cut into 5 mm rings to observe its response to acethylcholine in exvivo organ bath.

Results: With prolonged modeling time, the rats at different groups presented normal vessel structure, endothelial cell damage, vessel smooth muscle cell proliferation, atherosclerosis plaque formation and calcified plaque formation for different

pathological characteristics. The endothelial-dependent vasodilatation was decreased and the maximum vasodilatation percentage in Control group, AS 8W group, AS 12W group and AS 15W group were at (93.46 ± 2.80) %, (82.58 ± 3.25) %, (61.19 ± 3.72)% and (41.28 ± 2.68)% respectively, P＜0.05 between each group. The CyPA expression in endothelial cell and vessel smooth muscle cell were increased accordingly in 4 groups by OD value as (0.25 ± 0.06), (0.34 ± 0.09), (0.53 ± 0.09) and (0.68 ± 0.13) respectively, P＜0.05 between each group.

Conclusion: The CyPA expression increased and the endothelial-dependent vasodilatation decreased with the progress of atherosclerosis accordingly in experimental rats. The expression level of CyPA is related to atherosclerosis degree and it is one of the initial factors for atherosclerosis in rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:576.)

動脈粥樣硬化以內皮功能障礙為起始事件，氧化應激、炎癥反應等貫穿了動脈粥樣硬化的發病過程[1，2]。近年來，親環素A（cyclophilin A，CyPA）與氧化應激、動脈粥樣硬化的關系引起了廣泛關注。CyPA被認為是重要的氧化應激誘導因子，可在氧化應激刺激下由內皮細胞、血管平滑肌細胞分泌[3]。CyPA刺激血管平滑肌細胞增殖以及炎癥細胞遷移，引起內皮細胞凋亡，導致內皮功能障礙，參與動脈粥樣硬化的發病過程[4]。有研究探討了血清CyPA濃度與急性冠狀動脈綜合征的關系，發現急性冠狀動脈綜合征患者血清CyPA濃度明顯高于穩定性心絞痛和正常對照者血清水平[5]。但是CyPA在動脈粥樣硬化病理過程中各階段的表達變化以及伴隨的內皮依賴性舒張功能的變化目前尚少見報道。本研究旨在揭示大鼠動脈粥樣硬化病理過程中CyPA在動脈壁內皮細胞以及血管平滑肌細胞表達含量的變化，以及相應的內皮依賴性血管舒張功能的變化，為動脈粥樣硬化的預防和治療提供新的參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：實驗時間為2014-03至2014-07。無特定病原體（SPF）級健康雄性Wistar大鼠30只，體重180～200 g，湖北省實驗動物研究中心提供，分籠飼養在武漢大學動物實驗中心SPF環境中，室內溫度（22±1）℃,濕度（60±10）%,自由進食水，12 h明暗交替。

主要實驗藥劑：維生素D3注射液（上海通用藥業），膽固醇、膽酸鈉（武漢凱潤成生物工程有限公司），兔抗CyPA抗體（北京索萊寶科技有限公司），免疫組化SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。基礎飼料由武漢大學動物實驗中心提供，高脂飼料（81.3%普通飼料、5%蔗糖、10%豬油、3%膽固醇、0.5% 膽酸鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶）由湖北萬千佳興生物科技有限公司加工。

主要儀器：BL-420S 生物機能實驗系統、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統、JH-2型張力換能器，由成都泰盟公司生產。YB-6型生物組織包埋機（上海華巖儀器有限公司），RM2016型Leica石蠟切片機（德國leica公司），OLYMPUS BX51照相顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

所有大鼠經3天適應性喂養后隨機分為4組，對照組6只以及動脈粥樣硬化8周組（AS 8W組）8只，動脈粥樣硬化12周組（AS 12W組）8只，動脈粥樣硬化15周組（AS 15W組）8只。各組大鼠造模時間不同，以保證同期處死采集標本。造模方法參考文獻[6]。各動脈粥樣硬化組給予高脂飼料喂養，并在分組后第2天給予一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬IU/kg。對照組給予普通基礎飼料喂養，腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 取材

同期對各組大鼠進行取材。過量水合氯醛麻醉處死大鼠，快速分離腹主動脈，剔除周圍組織。

離體血管環內皮依賴性舒張功能測定：每條腹主動脈截取約5 mm長血管環連接到JH-2型張力換能器，置于含Krebs液的HV-4離體恒溫組織器官灌流系統，給予2 g張力負荷，通入95%O2和5%CO2的混合氣體，在37℃水浴中平衡1 h。以10-6mol/L去甲腎上腺素預刺激血管環，張力達平衡后加入不同濃度的乙酰膽堿（10-9～10-4mol/L）, 記錄每一濃度下血管環的張力，繪制濃度反應曲線。

蘇木素伊紅（HE）染色：新鮮腹主動脈以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蠟包埋，切片（橫切，片厚2 μm），按照HE染色步驟染色，置于400倍光鏡下觀察并攝片。

免疫組織化學SP法染色與數據采集： 石蠟切片按照免疫組化SP法步驟進行染色。以胞漿胞膜出現棕黃色染色為CyPA染色陽性。每張切片隨機抽取3個不同的400倍視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化結果進行分析，測定其平均光密度（平均光密度=累積光密度/測量區域面積）。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 離體動脈環內皮依賴性舒張功能測定

在器官浴槽中加入不同濃度（ 10-9～10-4mol/L）的乙酰膽堿后各組大鼠動脈環均出現內皮依賴性血管舒張反應。如表1所示，對照組動脈環內皮依賴性舒張功能良好，最大舒張度達（93.46±2.80）%。而AS 8W組、AS 12W組、AS 15W組最大舒張度都有不同程度下降，AS 15W組下降程度最為明顯，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。另外，在加入乙酰膽堿10-9mol/L 、10-8mol/L 、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L濃度后，各組之間舒張度比較差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表1 不同濃度乙酰膽堿下不同組別大鼠動脈環的內皮依賴性舒張度的比較

表1 不同濃度乙酰膽堿下不同組別大鼠動脈環的內皮依賴性舒張度的比較

注： AS：動脈粥樣硬化

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2.2 大鼠腹主動脈HE染色結果

光鏡下，對照組腹主動脈內膜完整光滑，內皮細胞排列整齊，無增生；平滑肌細胞排列規則，無增生；彈性纖維連續無中斷（圖1A）。AS 8W組可見內皮細胞增生，凋亡，內膜失去連續性；平滑肌細胞增生，排列紊亂（圖1B）。AS 12W組可見明顯粥樣斑塊形成，內膜局部區域可見明顯炎性細胞以及泡沫細胞浸潤，細胞外基質明顯增多，多處內膜脫落（圖1C）。AS 15W組可見內膜斷裂，中層鈣化斑塊形成，彈性層失去連續性，可見少量泡沫細胞形成（圖1D）。

2.3 大鼠腹主動脈CyPA免疫組化檢測結果

光鏡下觀察各組大鼠腹主動脈CyPA免疫組化染色，可見各組大鼠腹主動脈內皮細胞和平滑肌細胞胞漿均有CyPA表達（圖2A～2D）。各組平均光密度結果： AS 15W組大鼠鈣化斑塊內部CyPA表達較對照組升高最為顯著（0.68 ± 0.13 vs 0.25 ± 0.06, P＜0.05），AS 8W組以及AS 12W較對照組CyPA表達明顯升高（0.34±0.09，0.53± 0.09 vs 0.25±0.06, P＜0.05），各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠腹主動脈切片HE染色（×400）

圖2 大鼠腹主動脈親環素A免疫組化（×400）

3 討論

CyPA屬于親環素家族，被認為是強效的免疫抑制劑環孢素A（cyclosporin A,CsA）的胞內受體。CyPA具有肽酰脯氨酰順反異構酶活性，在蛋白質折疊、運輸、細胞內信號傳導等方面起了重要作用。氧化應激，由于體內過多的活性氧物質（ROS）而產生，促進了心血管疾病的發生[7]。Satoh等[8]證實，CyPA可以在氧化應激刺激下由血管平滑肌細胞分泌至胞外。分泌的CyPA通過刺激VSMC增殖以及炎癥細胞遷移，促進內皮細胞凋亡以及表達白細胞黏附分子，刺激白細胞遷移，增強巨噬細胞的增殖擴散，以及增強血管平滑肌細胞的促炎信號轉導等途徑促進炎癥反應以及動脈粥樣硬化[9]。另外，體外研究也證實了CyPA導致內皮細胞功能障礙的能力[10]。

本研究使用高脂飼料喂養配合維生素D3注射大鼠建立動脈粥樣硬化模型。高脂飲食可刺激大鼠體內氧化應激水平的升高[11]，相伴隨的是CyPA分泌的增多，而分泌的細胞外CyPA刺激血管平滑肌細胞中細胞外信號調節激酶1/2（extrallular signal regul.ated protein kinase1/2，ERK1/2）, 蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threoninekinase,Akt）和酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）等信號通路,進一步參與了ROS產物的生成，兩者形成惡性循環[8]。

既往的研究觀察到了動脈粥樣斑塊部位高表達的CyPA，但對于動脈粥樣硬化疾病發生發展過程中動脈壁CyPA表達的變化鮮有報道。本研究動態觀察大鼠動脈粥樣硬化發展過程中各個階段，通過比較正常、內皮改變、動脈粥樣斑塊形成、鈣化等不同時期的大鼠腹主動脈CyPA表達量的差異，明確了CyPA在動脈粥樣硬化疾病發展過程中的表達變化，證實了CyPA與動脈粥樣硬化疾病嚴重程度的關系。我們發現隨著造模時間的進展，大鼠腹主動脈正常的結構逐步破壞，至第8周可見內皮細胞凋亡，內皮依賴性舒張功能較正常組下降，這一發現與國外眾多相關研究[12,13]所提出的“內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的早期事件”結論一致。在這一時期，我們觀察到血管壁CyPA的表達較正常組已有升高。所以，我們認為CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一。12周后，隨著CyPA表達水平的進一步升高，刺激炎癥細胞遷移，加劇炎癥反應，血管結構上可見動脈粥樣斑塊形成，斑塊部位可見炎性細胞浸潤，泡沫細胞形成，內皮依賴性舒張功能相對第8周時明顯下降。隨著炎癥進展，多種炎癥介質誘導了血管壁成骨細胞的表達和活化，導致鈣質沉積[14]。所以，至15周我們觀察到了鈣化斑塊的形成，而CyPA的表達較前一階段有明顯升高。

綜上所述，我們認為，高脂飲食誘導了大鼠體內氧化應激水平的升高，刺激血管平滑肌細胞分泌CyPA。而分泌至胞外的CyPA進一步加劇氧化應激，誘導炎癥反應，促進泡沫細胞形成，逐步導致內皮損傷、粥樣斑塊形成、鈣化斑塊形成。我們認為CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一,CyPA促進了動脈粥樣硬化的發生發展。CyPA與動脈粥樣硬化病變的嚴重程度有關，其表達含量隨著病變的進展而隨之升高，CyPA可以成為動脈粥樣硬化預防和治療的新靶點。

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The Changes of Endothelial-dependent Vasodilatation and Cyclophilin A Expression at Different Phases of Atherosclerosis in Experimental Rats

SHENG Chong-xiao, LI Hong-hua, LIU Kang, FENG Hai-song.
Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan (430070), Hubei, China

Objective: To observe the changes of endothelial-dependent vasodilatation and cyclophilin A (CyPA) expression at different phases of atherosclerosis in experimental rats.

Atherosclerosis; Cyclophilin A; Endothelial-dependent vasodilatation

2014-09-16）

（編輯：漆利萍）

湖北省自然科學基金（2013CFB428）

430070 湖北省武漢市，中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院 神經內科

盛沖霄 碩士研究生 主要從事氧化應激與動脈硬化研究 Email：474953755@qq.com

黎紅華

Email：Lihonghua567@aliyun.com

R541

A

1000-3614（2015）06-0576-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.017