乳腺癌易感基因1和切除修復交叉互補基因1 mRNA在乳腺癌中的表達及意義*

梁夢，王敏，朱蓓蓓，張會芳，盧仙球

（1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，浙江 杭州 310005；2.暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510632）

·論著·

乳腺癌易感基因1和切除修復交叉互補基因1 mRNA在乳腺癌中的表達及意義*

梁夢1，王敏1，朱蓓蓓2，張會芳1，盧仙球1

（1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，浙江 杭州 310005；2.暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510632）

目的研究乳腺癌易感基因1（BRCA1）和切除修復交叉互補基因1（ERCC1）在乳腺癌發生、發展中的作用及臨床意義。方法采用原位雜交技術（ISH）檢測BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病變和乳腺癌組織芯片中的表達，以及與乳腺癌臨床病理因素的關系。結果①BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌旁正常組織、乳腺癌癌前病變及乳腺癌組織中的陽性表達率呈遞減趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。②BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌的表達差異顯著并具有相關性（P＜0.01）。③BRCA1 mRNA的陽性表達與乳腺癌組織學分級、腫瘤大小呈負相關（P＜0.05），與發病年齡、臨床分期和淋巴結轉移無關（P＞0.05），ERCC1 mRNA的表達與腫瘤大小和淋巴結轉移相關（P＜0.05），與患者發病年齡、組織學分級及臨床分期無關（P＞0.05）。結論BRCAl與ERCC1 mRNA表達的減少可能與乳腺癌的發生發展有關，兩基因的聯合檢測有利于乳腺癌的早期診斷與治療。

乳腺癌癌前病變；乳腺癌；乳腺癌易感基因1（BRCA1）；切除修復交叉互補基因1（ERCC1）；原位雜交

近年來，隨著乳腺癌發病率的逐年遞增，針對其發病機制及治療方案的探索成為研究熱點。許多研究表明，DNA的損傷修復能力在一定程度上決定腫瘤的發生[1]，各種原因所致的DNA修復基因異常突變及甲基化都可引起其功能的失活和表達缺失，導致細胞基因組的不穩定，罹患乳腺癌的風險增大[2-3]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和切除修復交叉互補基因1（excision repair cross-complement gene 1，ERCC1）作為DNA損傷修復路徑的關鍵因子，在維系生物體基因組的穩定及組織細胞的生長中起著重要的作用。本研究以高通量、多樣本乳腺疾病組織芯片為基礎，結合原位雜交技術（in situ hybridization，ISH）聯合檢測BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達，以探討其在乳腺癌發生、發展中的作用及相互關系，為乳腺癌發病的早期基因篩查及臨床診治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺疾病組織芯片購自陜西超英生物科技有限公司，內含乳腺組織標本芯粒68例。其中患者年齡22～83歲，中位年齡50歲。乳腺癌36例（浸潤性導管癌23例，浸潤性小葉癌4例，髓樣癌3例，黏液癌3例，導管內癌3例），乳腺癌癌前病變22例（乳腺增生性病變13例，不典型增生9例），癌旁遠端正常乳腺組織10例。每例點樣直徑1.5 mm，厚5μm，各點樣經病理復閱確診。上述病例均為散發性女性患者，無乳腺癌家族史，其中36例癌癥患者術前均未接受放射及化學治療。

1.2 方法

試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，為多相寡核苷酸探針，地高辛高敏感標記，BRCA1的序列為：5'-TCTTAGAGTGTCCCATCTGTCTGGAGTTGA-3'；5'-TTCATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGATAA-3'；5'-AGCCAGATGCCTGGACAGAGGACAATGGCT-3'。ERCC1的序列為：5'-CCTCAGACCTACGCCGAATAT GCCATCTCACAGCC-3'；5'-TTCGTGCGCAATGTGCC CTGGGAATTTGGCGACGT-3'；5'-GCTACCACAACC TCACCCAGACTACATCCATGGG-3'。探針標記及雜交檢測程序按試劑盒說明書操作，以試劑盒內配置陽性切片為陽性對照標準，經RNA ase消化1 h后雜交為陰性對照組。雜交液中不加探針結果為陰性。若出現非特異性染色，通過不加探針及陰性樣本做對照加以排除。

1.3 結果評定標準

顯色后芯粒完整，無掉片組織點，原位雜交陽性信號為胞漿呈棕黃色或棕褐色（見圖1）。無明顯陽性反應細胞為陰性（-）；陽性細胞＞10%、染色較強者為陽性（+）。

圖1 乳腺癌芯片大體圖（ISH×40）

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，樣本間比較用χ2檢驗及Fishers精確檢驗，兩因素相關性用Spearman等級相關分析法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRCA1 mRNA的表達

原位雜交結果顯示，BRCA1的mRNA陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒分布于細胞漿（見圖2）。癌旁正常組織、癌前病變及癌組織的陽性表達率分別為80.0%（8/10）、40.9%（9/22）和16.7%（6/36），3組間陽性表達率呈遞減趨勢，且表達差異具有相關性，有統計學意義（χ2=14.754，P=0.001）。同癌旁正常組織比較，BRCA1 mRNA在癌前病變及癌組織中的陽性表達率明顯下降（χ2=4.219，P＜0.05；χ2=14.827，P＜0.05），而其在乳腺癌癌前病變中的表達亦明顯高于乳腺癌中的表達，差異有統計學意義（χ2=4.185b，P＜0.05）。見表1。

2.2 ERCC1 mRNA的表達

經原位雜交檢測，ERCC1 mRNA表達信號定位于細胞漿（見圖2），其在乳腺癌旁正常組織、癌前病變及癌組織的陽性表達率呈遞減趨勢，分別為90.0%（9/10）、50.0%（11/22）和22.2%（8/36），3者間陽性表達差異具有相關性，有統計學意義（χ2=15.888，P=0.000）。與癌旁正常組織比較，ERCC1 mRNA在癌前病變及癌組織中的陽性表達率下降明顯，有統計學意義（χ2=4.693，P＜0.05；χ2=15.431，P＜0.01），而乳腺良性病變同乳腺癌比較，ERCC1 mRNA陽性表達下降明顯，有統計學意義（χ2=4.783，P＜0.05）。見表1。

圖2 BRCA1和ERCC1 mRNA的ISH檢測（×200）

表1 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺病變中的表達

2.3 BRCA1與ERCC1 mRNA在乳腺癌中表達的相關性

通過對BRCA1、ERCC1 mRNA表達的相關分析，30例BRCA1 mRNA陰性表達的乳腺癌中，ERCC1 mRNA陽性表達2例，而6例BRCA1 mRNA陽性表達的乳腺癌中，ERCC1 mRNA也同時陽性表達，兩者比較差異有統計學意義（P=0.000），相關系數檢驗兩者顯著相關（r=0.837，P＜0.01）。見表2。

表2 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌中表達的相關性例

2.4 BRCA1和ERCC1 mRNA表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

BRCA1 mRNA的陽性表達與乳腺癌組織學分級和腫瘤大小呈負相關（χ2=4.425，P＜0.05；χ2=6.545，P＜0.05），與患者發病年齡、臨床分期和淋巴結轉移無關（P＞0.05），ERCC1 mRNA表達與淋巴結轉移和腫瘤大小呈負相關（χ2=4.251和8.233，P＜0.05），與患者發病年齡、組織學分級、臨床分期無關（P＞0.05）。見表3。

表3 BRCA1和ERCC1 mRNA表達與乳腺癌臨床病理特征的關系例（%）

續表3

3 討論

20世紀90年代，人們通過對早發型乳腺癌和卵巢癌的家族遺傳基因譜系分析，發現BRCA1作為一種特異而典型的抑癌基因，在人類乳腺腺管形成、細胞分化及上皮細胞增殖過程中起重要作用[4]。近年來，多數學者認為乳腺癌高危患者有家族遺傳性BRCA1基因突變，其雜合性丟失、表達的不穩定性等因素均與乳腺癌的發病密切相關[5-7]，而其在非家族散發性乳腺癌中未發現突變，僅有報道該基因蛋白及mRNA水平在散發性乳腺癌組織中的表達明顯下降或失表達并有部分異位表達現象[8-10]。有研究表明，從乳腺上皮增生到癌的發生可能是連續進展的過程，若將癌旁正常組織的基因改變與癌組織進行比較，基本可以反映該基因在乳腺癌發生和進展中的作用[11]。本研究結果顯示，與癌旁正常組織比較，BRCA1 mRNA在癌前病變及癌組織的陽性表達率明顯下降，且具有等級相關性（P＜0.05），進一步證實BRCA1在乳腺疾病由良性向惡性轉變的過程中起重要作用[12]。另有研究顯示，該基因的表達與乳腺癌的組織學分級和腫瘤大小呈負相關，提示BRCA1的異常表達與散發型早期乳腺癌的發生、發展和不良預后密切相關[13]。通過對特定人群BRCA1的檢測，有利于乳腺癌及其他相關惡性腫瘤的早期診斷與治療。

ERCC1是一種高度保守的單鏈DNA核酸內切酶，該基因所編碼的297個氨基酸可參與DNA修復系統中的核苷酸切除修復路徑修復損傷，以確保基因組的完整性。有關腫瘤發生和發展的學說認為，腫瘤是致癌相關的危險因素暴露造成DNA的損傷，再加上DNA修復基因表達低下，使基因損傷不斷地在上皮細胞內累積，導致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續事件的發生[14]。當ERCC1表達低下時，其對損傷細胞的修復能力亦減弱，從而使損傷細胞在體內不斷積聚，最終導致癌癥的發生，因此ERCC1低表達常伴隨著癌癥發病率的增加，而過表達與化療耐藥有關[15]。本研究發現，同癌旁正常組織相比，ERCC1在癌前病變及癌組織中的陽性表達率下降明顯（P＜0.05，P＜0.01），且在腫塊較大，有淋巴結轉移者中表達率減少，不僅證實ERCC1基因低表達與乳腺癌的發生有關，也提示預后不佳。目前，認為該基因的表達可作為判斷腫瘤易感性的一個有價值的生物標志[16]，也為治療及預后評估提供導向。

綜上所述，BRCA1、ERCC1基因作為DNA修復系統中的2個關鍵因子，在乳腺癌的發生、發展過程中起重要作用且可能具有相關協同性，目前國內對兩基因的檢測多集中于蛋白表達方面，本研究則側重于mRNA水平的研究，通過原位雜交技術對兩基因進行聯合檢測。原位雜交技術同其他技術相比具有操作流程簡便、可與多種檢測方法合并，并易于將mRNA基因活性同組織細胞形態相結合，已較為普遍地為研究者們所應用。本實驗研究以期通過兩修復基因的表達改變反映乳腺癌的發生、發展過程，為乳腺癌及其他相關惡性腫瘤的高危篩檢提供幫助。

[1]王芹,劉強,樊賽軍,等.XRCC1基因單核苷酸多態性與腫瘤易感性[J].中國臨床醫師雜志,2014,8(6):1123-1126.

[2]韋曄,李建祥.DNA修復基因甲基化與腫瘤發生關系的研究進展[J].基礎醫學與臨床,2013,33(4):500-503.

[3]CLARICE P,SILVIA S,ANTONELLA T,et al.Polymorphisms in base excision repair genes:breast cancer risk and individual radiosensitivity[J].World Journal of Clinical Oncology,2014,5(5): 874-882.

[4]任婕,魏敏杰,金鋒,等.散發性乳腺癌中影響BRCA1蛋白失表達的參數分析[J].中國腫瘤臨床,2008,35(2):99-103.

[5]SIMARD J,DUMONT M,MOISAN AM,et al.Evaluation of BRCA1 and BRCA2 mutation prevalence,risk prediction models and a multistep testing approach in French-Canadian families with high risk of breast and ovarian cancer[J].J Med Genet, 2007,44(2):107-121.

[6]AHN SH,SON BH,YOON KS,et al.BRCA1 and BRCA2 germline mutations in korean breast cancer patient s at high risk of carrying mutations[J].Cancer Lett,2007,245(1/2):90-95.

[7]韋薇,李秋云,唐瑋,等.BRCA1基因在散發性乳腺癌中的表達及異常甲基化[J].重慶醫學,2015,44(9):1174-1176.

[8]RAKHA EA,EL-SHEIKH SE,KANDIL MA,et al.Expression of BRCA1 protein in breast cancer and its prognostic significance[J]. Hum Pathol,2008,39(6):857-865.

[9]方宏才,張國強,曹傳培,等.BRCA1和IGF1R在乳腺良惡性腫瘤中的表達及其意義[J].廣東醫學,2010,31(1):90-92.

[10]FU YY.The function of BRCA1 gene and its structure features upstream regulation sequence[J].Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis,2002,4(1):47-49.

[11]馬金柱,張嘉玲,劉明,等.BRCA1與p53在散發性乳腺癌中的表達[J].實用腫瘤雜志,2011,26(3):233-235.

[12]馬文浩,韓玉貞,桑晶,等.BRCA1在散發性乳腺癌干細胞中的表達及意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2012,28(1):19-21.

[13]ZHANG QL,ZHANG QH,CONG H,et al.The ectopic expression of BRCA1 is associated with genesis,progression,and prognosis of breast cancer in young patients[J].Diagn Pathol, 2012,7(1):181.

[14]梁發,謝忠.ERCC1、BRCA1在胃癌中的研究進展[J].齊齊哈爾醫學院學報,2011,32(2):262-264.

[15]林肖鷹,陳小巖,黃穎.切除修復交叉互補基因1在乳腺癌中的表達及意義[J].臨床腫瘤學雜志,2013,18(12):1096-1099.

（申海菊 編輯）

Expression of BRCA1 and ERCC1 mRNA in breast tumor and its clinical significance*

Meng LIANG1,Min WANG1,Bei-bei ZHU2,Hui-fang ZHANG1,Xian-qiu LU1
(1.The Third Affiliated Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang 310005,P.R.China;2.The First Affiliated Hospital,Jinan University, Guangzhou,Guangdong 510632,P.R.China)

【Objective】To investigate the role of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)and excision repair cross-compliment gene 1(ERCC1)in the development and progression of breast cancer and their clinical significance.【Methods】The mRNA levels of BRCA1 and ERCC1 in precancerous lesions and breast cancers were determined by in situ hybridization(ISH)using a tissue microarray,their correlation and clinicopathological factors were determined in 36 cases of breast cancer patients.【Results】①The positive rates of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the normal tissues adjacent to breast cancer,the breast precancerous lesions and the breast cancer tissues progressively decreased；their expressions in the three kinds of tissues were significantly different(P＜0.05).②The expressions of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the breast cancer were significantly different and correlated(P＜0.01).③The positive expression of BRCA1 mRNA was in negative correlations with the histological grade and tumor size of the breast cancer(P＜0.05),and unrelated to the age of onset,clinical stage or lymph node metastasis.The expression of ERCC1 mRNA was in negative correlations with tumor size and lymph node metastasis(P＜0.05),but not significantly correlative to other clinic pathological features(P＞0.05).【Conclusions】Down-regulation of BRCA1 and ERCC1 mRNA may be corre－lated with development and progression of breast cancer,and combined examination of both genes may be helpful for early diagnosis and treatment of this disease.

breast precancerous lesion；breast cancer；breast cancer susceptibility gene 1；excision repair cross-compliment gene 1；in situ hybridization

R737.9

A

1005-8982（2015）29-0018-05

2015-03-09

浙江中醫藥大學附屬第三醫院醫藥衛生科研計劃基金（No：ZS12CA07）