血管緊張素原基因多態性與中國部分少數民族原發性高血壓的相關性*

牛淑冬，卓瑪次仁，張彬，崔超英，格桑羅布，邊巴，朱鵬程，張明濤，佟偉軍，孫玉晶，岑維浚，李靜平，邱長春

[1.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.西藏自治區人民醫院心內科，西藏 拉薩 850000；3.中國醫學科學院基礎醫學院（醫學分子生物學國家重點實驗室），北京 100005；4.西藏大學醫學院高原醫學研究中心，西藏 拉薩 850000；5.新疆醫科大學第四附屬醫院心內科，新疆 烏魯木齊 830054；6.新疆阿勒泰地區人民醫院心內科，新疆 阿勒泰 836500；7.內蒙古通遼衛生防疫站，內蒙古 通遼 028000]

·臨床論著·

血管緊張素原基因多態性與中國部分少數民族原發性高血壓的相關性*

牛淑冬1，卓瑪次仁2，張彬3，崔超英4，格桑羅布2，邊巴4，朱鵬程5，張明濤6，佟偉軍7，孫玉晶3，岑維浚2，李靜平1，邱長春1

[1.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.西藏自治區人民醫院心內科，西藏 拉薩 850000；3.中國醫學科學院基礎醫學院（醫學分子生物學國家重點實驗室），北京 100005；4.西藏大學醫學院高原醫學研究中心，西藏 拉薩 850000；5.新疆醫科大學第四附屬醫院心內科，新疆 烏魯木齊 830054；6.新疆阿勒泰地區人民醫院心內科，新疆 阿勒泰 836500；7.內蒙古通遼衛生防疫站，內蒙古 通遼 028000]

目的研究血管緊張素原（AGT）基因多態性位點M235T、A-6G、A-20C及其單倍型（M235T-A-6GA-20C）與中國部分原發性高血壓（EH）高發的少數民族（蒙古族、哈薩克族、藏族）EH易感性的關系，比較AGT對不同民族人群EH發病風險的影響。方法應用聚合酶鏈反應（PCR）及限制性片段長度多態性（RFLP）技術判定基因型，采用Haploview軟件進行單倍型分布分析。結果哈薩克族EH組-6G分布顯著高于對照組（42.34%vs 36.98%，P=0.009）。藏族EH組20C分布顯著低于對照組（18.17%vs23.19%，P=0.038）。哈薩克族EH組M-A-A的分布頻率顯著低于對照組（38.16%vs 47.50%，P=0.001），而EH組M-G-A分布頻率顯著高于對照組（16.20%vs 8.61%，P=0.000）。藏族EH組T-A-A分布頻率顯著高于對照組（71.89%vs 64.15%，P=0.006）。結論AGT多態性與EH的相關性具有顯著的種族異質性，M235T、A-6G、A-20C與中國蒙古族EH發病風險無關，-6G與哈薩克族EH易感性升高相關，而20A可能降低藏族EH的發病風險；單倍型M-G-A和T-A-A可能分別與哈薩克族和藏族EH易感性升高相關，而M-A-A可能是哈薩克族抗EH的保護性因素。

原發性高血壓；血管緊張素原基因；基因多態性；單倍型；中國少數民族

流行病學調查顯示，原發性高血壓（essential hypertension，EH）在中國各民族的發病率差異較大，生活在高原地區或北方的藏族、哈薩克族和蒙古族等患病率較高，生活在南方或非高原地區的苗族、壯族等患病率則較低[1]。2002年統計結果表明，藏族EH患病率（24.7%）為中國各民族之首，哈薩克族為18.97%，蒙古族為17.6%。患病率的差異表明各民族人群的EH易患性、易感性不同，因此對不同民族人群開展EH的分子遺傳學研究，對加強EH預防、探索EH個體化診斷與治療具有重要意義。

血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的初始底物，在腎素的作用下水解為血管緊張素Ⅰ，后者在其他酶的作用下轉變為血管緊張素Ⅱ、Ⅲ，影響水、鹽代謝及血管阻力，進而影響血壓[2]。AGT基因位于染色體1q42、43區，全長1 030 bp。由5個外顯子和4個內含子組成，是最早發現，也是目前為止研究最多的EH候選基因。大量研究表明AGT單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNPs）與EH有關，但研究結果并不一致[3]，中國各地區、各民族的研究結果也各不相同，提示AGT多態性與EH的相關性具有顯著的種族異質性[4-5]。

本文總結課題組多年來以人群為基礎的病例-對照研究結果，分別探討A-6G、A-20C、M235T 3個多態性位點的等位基因、基因型、單倍型分布頻率與蒙古族、哈薩克族及藏族EH相關性，旨在比較分析AGT基因在中國部分EH高發的民族、地區對EH發病風險的影響。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

引物購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司，Mycycler Thermal Cycler擴增儀購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，直接測序委托北京華大中生科技發展有限公司完成。

1.2 研究對象

研究對象為≥3代居住于所在地區的長期穩定居民，與其他民族無通婚史。EH患者入選標準采用《1999年WHO/ISN高血壓治療指南》：①收縮壓（systolic pressure，SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（diastolic pressure，DBP）≥90 mmHg；②20～60歲發病；③排除繼發性高血壓、糖尿病、腎病等慢性疾病；④未進行抗高血壓藥物治療。按性別、年齡、職業匹配選擇正常對照人群，年齡＞40歲，SBP≤130 mmHg和DBP≤80 mmHg。該項研究獲得齊齊哈爾醫學院醫學倫理委員會批準，所有參加調查對象簽署知情同意書。

各民族研究對象及所在地區如下：①蒙古族：EH組243例，對照組258例，全部來自內蒙古自治區；②哈薩克族：EH組521例，對照組623例，全部來自新疆阿勒泰地區；③藏族：EH組333例，對照組235例，全部來自西藏自治區拉薩市。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組制備采集外周靜脈血5 ml，采用低滲法破除紅細胞，酚-氯仿抽提法抽提、純化。DNA純度達A260∶A280≥1.80。

1.3.2 基因分型采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）及限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術判斷基因型，并隨機選取10%的樣本直接測序，驗證PCR-RFLP分型的準確性。

PCR擴增反應引物序列：A-20C（rs5050）和A-6G（rs5051），正向引物：AGAAATCCCAGCGTGAGTGT，反向引物：AGAC CAGAAGGAGCTGAGGG；M235T（rs699），正向引物：CAGGGTGGTCCACACTGGACCCC，反向引物：CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT。PCR擴增反應體積為25μl，反應體系內含10×PCR緩沖液，200μmol/L dNTPs，10 pmol引物，50 ng模板DNA，Taq聚合酶1 u。PCR擴增反應條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環，72℃繼續延伸5 min。各取每種PCR產物5μl，分別采用內切酶Eco109Ⅰ、BstNI、TthⅢ，按推薦條件進行限制性酶切反應，以鑒定A-20C、A-6G、M235T基因型。酶切產物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察鑒定。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，等位基因和基因型頻率估算用直接基因計數法，組間比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因型與等位基因頻率分布

蒙古族人群中，M235T、A-6G、A-20C在EH組和對照組的基因型及等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義。哈薩克族人群中，A-6G在EH組和對照組的基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P= 0.010），且-6G在EH組的分布頻率顯著高于對照組（P=0.009）。藏族人群中，EH組-20C分布頻率顯著低于對照組（P=0.038）。見表1。

表1 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因型/等位基因頻率分布

2.2 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因的M235T-A-6G-A-20C單倍型分布頻率

蒙古人群中有6種分布頻率＞1%的單倍型，各單倍型在EH組和對照組比較差異均無統計學意義。哈薩克族人群中有6種分布頻率＞1%的單倍型，其中M-A-A在EH組的分布頻率顯著低于對照組（P=0.001），而M-G-A在EH組分布頻率顯著高于對照組（P=0.000）。藏族人群中有8種分布頻率＞1%的單倍型，其中T-A-A在EH組分布頻率顯著高于對照組（P=0.006），而M-G-A和T-A-C分布頻率顯著低于對照組（P＜0.05）；但經嚴格的Bonferroni校正后，M-G-A和T-A-C在藏族EH組和對照組的分布頻率比較，差異無統計學意義。見表2。

續表1

表2 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因M235T-A-6G-A-20C單倍型分布頻率%

3 討論

AGT基因中，位于第2外顯子的M235T是外顯子中最重要的多態性位點之一。據文獻報道，M235T與白種人、日本人EH相關[3]，與血漿AGT水平相關，235TT純合子較235MM純合子EH易感性升高11%[6]。但本研究中，M235T與中國藏族、哈薩克族、蒙古族EH易感性無明顯相關。該結果與孔祥東等[5]的研究結果一致，但與WANG等[4]的研究結果不符。由于M235T不是AGT蛋白的酶切位點，不會影響AngⅡ的生成；同時M235T并不影響AGT基因的轉錄和翻譯，因此有研究者認為，M235T可能是附近與EH有關的突變的遺傳標記，M235T多態性與EH的關聯是通過血管緊張素原基因核心啟動子（angiotensinogen core promoter element 1，AGCE1）序列介導的。AGCE1位于TATA盒和轉錄起始位點之間，可結合一種廣泛表達的轉錄因子AGT核心啟動子結合因子1（human AGT gene core promoter element binding factor 1，AGCF1），對AGT轉錄起始及基因表達方式產生重要影響[7]。該區域的A-6G、A-20C與M235T位點完全連鎖不平衡[8]，其中A-6G直接影響AGT基因基礎轉錄速率，A-20C變異影響人體血漿中AGT和血管緊張素Ⅱ的水平，上述變異均與EH顯著相關。

在中國各民族人群中，A-6G、A-20C多態性與EH的關聯具有明顯的民族差異性[5，9]。本研究中，A-20C與蒙古族、哈薩克EH組無明顯相關，該結果與孔祥東等[5]的研究結果一致，但在藏族人群中，EH組-20C分布頻率顯著低于對照組，提示C等位基因可能是藏族人群EH的抗性因素。目前，關于A-6G的報道尚無一致結果，李南方等[10]報道-6G變異與哈薩克族EH有關；LIU等[9]報道，A-6G與漢族和彝族的EH無關聯；本研究結果顯示，-6G與哈薩克族EH顯著相關，可能是哈薩克EH的風險因子。上述研究結果的矛盾可能由多種因素造成。首先，AGT合成受多種因素調控，如AGT基因5'-端非編碼區的雌激素、糖皮質激素、甲狀腺素和應激反應調控元件，啟動子附近區域的AGE2和AGE3順式作用元件等[11]，擴大研究位點的范圍可能更有助于揭示不同種族、不同民族AGT基因多態性在EH發病中的作用。此外，由于性別的分層原因導致的假關聯、上位效應也是不易排除的因素。

對于蒙古、哈薩克、藏族AGT基因單倍型的研究結果顯示，含有A-20C-A-6G-M235T多態性位點的單倍型與蒙古族EH無關；攜帶M-G-A的哈薩克族和攜帶T-A-A的藏族人群患EH風險顯著升高，提示上述兩種單倍型可能是哈薩克族和藏族人群的EH風險因子；而M-A-A在哈薩克族EH組中的分布頻率顯著低于對照組，表明該單倍型可能是哈薩克族人群的保護性因素。單倍型M-A-A與M-G-A比較，其差異僅在A-6G位點不同，說明A-6G位點在A-20C-A-6G-M235T單倍型中起很強作用。該結果與哈薩克族單個基因分析的結果相互支持，提示作為AGT基因核心啟動子區的多態性位點，A-6G是哈薩克族人群EH的一個重要影響因子。

本研究表明，同一多態性位點對不同民族EH發病的影響不同，進一步提示EH病因學的遺傳異質性和揭示不同民族EH遺傳學基礎的必要性。本項研究的優勢在于參與者均生活于環境較為封閉、人群流動性小的地區，遺傳背景單純，可有效代表所研究人群的遺傳特性，提高研究結果的準確性和和可信度。不足在于樣本量偏小，研究的位點有限，未能測定AGT的血漿濃度。需要擴大樣本量及研究位點的范圍以進一步明確AGT基因多態性對于中國各民族EH發病的影響。

[1]蘇秀蘭,常培葉.中國少數民族原發性高血壓候選基因研究進展[J].中國老年學雜志,2010,30(11):1621-1623.

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[4]WANG GY,WANG YH,XU Q,etal.Associations between RAS Gene polymorphisms,environmental factors and hypertension in Mongolian people[J].Eur J Epidemiol,2006,21(4):287-292.

[5]孔祥東,楊宇霞,張思仲.AGT基因單倍型與原發性高血壓[J].遺傳, 2004,26(6):797-802.

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[7]ARMANI C,BOTTO N,ANDREASS MG.Susceptibility genes in hypertension[J].Curr Pharm Des,2011,17(28):2973-2986.

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[10]李南方,周玲,吳衛東.血管緊張素原基因5'-端核心啟動子區（-6）AG和（-20）A-C變異與哈薩克族人原發性高血壓相關性分析[J].中華醫學遺傳學雜志,2004,21(1):23-27.

[11]THOMAS GN,YOUNG RP,TOMLINSON B,et al.Renin-angiotensin-aldosterone system gene polymorphisms and hypertension in HongKong Chinese[J].Clin Exp Hypertension,2000,22(1): 87-97.

（申海菊 編輯）

Association between angiotensinogen gene polymorphisms and essential hypertension in a part of Chinese minorities*

Shu-dong NIU1,Ci-ren ZHUO-MA2,Bin ZHANG3,Chao-ying CUI4,Luo-bu GE-SANG2, Ba BIAN4,Peng-cheng ZHU5,Ming-tao ZHANG6,Wei-jun TONG7,Yu-jing SUN3, Wei-jun CEN2,Jing-ping LI1,Chang-chun QIU1
[1.College of Basic Medical Sciences,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,P.R.China;2.Department of Cardiology,the People's Hospital of Tibet Autonomous Region,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;3.Institute of Basic Medical Sciences(National Laboratory of Medical Molecular Biology),Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,P.R.China;4.Institute of High Altitude Sickness,Medical College, Tibet University,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;5.Department of Cardiology,the Fourth Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumuqi,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 830054,P.R.China;6.Department of Cardiology,Altay RegionPeople's Hospital,Aletai,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 836500,P.R.China; 7.Tongliao Sanitation and Antiepidemic Station,Tongliao,Inner Mongolia Autonomous Region 028000,P.R.China]

【Objective】To study the association between angiotensinogen gene(AGT)polymorphic site M235T,A-6G,A-20C and the haplotype(M235T-A-6G-A-20C)and the susceptibility to essential hypertension(EH)in a part of high-risk minorities in China including Mongolian,Kazakh and Tibetan,and to compare the effect of AGT gene variations on EH in different minorities.【Methods】The polymorphisms were genotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP),the haplotype distribution was analyzed by Haploview software.【Results】In single locus study,the distribution of-6G was significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects(42.34%vs 36.98%,P=0.009)in Kazakhs；the distribution of-20C was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects (18.17%vs 23.19%,P=0.038)in Tibetans.In haplotype analysis,the distribution of M-A-A was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects(38.16%vs 47.50%,P=0.001)in Kazakhs,while the distributions of M-G-A and T-A-A were significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects in Kazakhs and Tibetans,respectively(M-G-A:16.20%vs 8.61%,P=0.000；T-A-A:71.89%vs 64.15%,P= 0.006).【Conclusions】The correlation between AGT polymorphisms and EH has showed significant ethnic heterogeneity.M235T,A-6G and A-20C are not associated with the susceptibility to EH in Mongolian population.-6G is associated with the increased risk of EH in Kazakhs；-20C may decrease the risk of EH in Tibetans.Haplotype M-G-A and T-A-A may increase the genetic susceptibility to EH in Kazakhs and Tibetans,respectively,and M-A-A may be a protective haplotype for Kazakhs.

essentialhypertension；angiotensinogengene；genepolymorphism；haplotype；Chinese minority

R394；R34

A

1005-8982（2015）29-0044-05

2015-03-09

國家自然科學基金（No：31171146；31371208；30393132）；國家重點基礎研究發展計劃項目（973計劃）（No：2006BAII9B07）

邱長春，E-mail：changchun_qiu@163.com；Tel：0452-2663389