響應曲面法優化木香有效成分的微波輔助提取工藝

張 玲，李 麗，王金莉

（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

木香為菊科云木香屬植物木香的干燥根，具有調中宣滯，行氣止痛，解痙、松弛平滑肌、抗炎等作用，獸醫臨床常用其改善反芻動物瘤胃環境，治療瘤胃積食（魏華，2012）。木香主要的活性成分為木香烴內酯和去氫木香內酯，均屬于倍半萜內酯，是木香質量控制的主要指標 （國家藥典委員會，2010）。響應面分析法（RSM）是利用中心組合試驗擬合出完整的二次多項式模型以優化工藝條件的方法（Li，2005）。通過求出的最佳參數，使得試驗設計與結果表達更加優良，最優組合條件也更直觀、更精確（范東斌等，2014；王萬中，2004）。 本研究采用微波輔助提取法提取木香中的木香烴內酯和去氫木香內酯，動用響應面法對提取工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 LC-10A高效液相色譜儀（日本島津株式會社）、EZChrom色譜工作站、UV-2550紫外分光光度計（日本島津株式會社）、水浴鍋（天津中環科技電子公司）、BP121S電子分析天平（德國賽多利斯）、DFY-200型粉碎機（溫嶺大德中藥粉碎廠）、微波提取裝置HWC-10B（廣州興興微波設備有限公司）。

1.1.2 試藥 木香，購自甘肅隴原中藥材開發有限責任公司；木香烴內酯標準品，來自中國藥品生物制品鑒定所（批號：111524-201203）；去氫木香內酯標準品，來自中國藥品生物制品鑒定所 （批號：111525-201205）；乙醇為醫用級；其他化學試劑為國產分析純；水為雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 木香烴內酯和去氫木香內酯的含量測定

1.2.1.1 對照品的制備 分別取木香烴內酯對照品和去氫木香內酯對照品適量，精密稱取，加甲醇溶解，分別配制成每毫升中含1 mg木香烴內酯和1 mg去氫木香內酯的對照品儲備液。分別從其中精密吸取1 mL至量瓶中，加甲醇定容至10 mL，即得含有木香烴內酯（100 μg/mL）和去氫木香內酯（100 μg/mL）的混合對照品溶液。

1.2.1.2 標準曲線的繪制 采用HPLC分析1.2.1.1中的混合對照品溶液，采用ZORBAX SBC18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μ），流動相為甲醇-水（65∶35），檢測波長為 225 nm，流速為 1 mL/min，進樣量為 3、5、10、15、20、25、30、35 μL，測得峰面積積分值。以峰面積積分值（A）為縱坐標，對照品溶液的進樣量（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得木香烴內酯和去氫木香內酯回歸方程和線性范圍：

Y=0.263X-6.435（r=0.9995）；

進樣量為72.42～914.07 ng時與峰面積有良好的線性關系。

1.2.1.3 木香有效成分的提取及提取率計算 參考錢偉（2013）的提取方法，取木香飲片，適當粉碎，精密稱取3.0 g木香，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，靜置12 h，選取適當微波功率和提取時間，損失的重量用甲醇補足，放冷，濾過。按1.2.1.2項的測定方法，結合回歸方程計算得到木香烴內酯和去氫木香內酯的質量，再計算提取率：

提取率=提取液中木香烴內酯和去氫木香內酯的質量/投藥量×100。

1.2.2 單因素試驗 本試驗分別選取微波功率、提取時間和料液比作為考察的單因素，按照1.2.1.3方法提取，并計算提取率。

1.2.2.1 微波功率對提取率的影響 在提取時間7 min、料液比 1∶15（g/mL）的條件下，研究微波功率（200、300、400、500、600 W）對提取率的影響。

1.2.2.2 提取時間對提取率的影響 在微波功率400 W、料液比 1∶15（g/mL）的條件下，研究提取時間（3、5、7、9、12 min）對提取率的影響。

1.2.2.3 料液比對提取率的影響 在微波功率400 W、提取時間7 min的條件下，研究料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對提取率的影響。

1.2.3 響應曲面試驗設計 在單因素試驗結果的最優水平基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以提取率（Y）為響應值，選取微波功率（W）、提取時間（min）和料液比（g/mL）三個影響因素，利用Design Expert 7.0軟件設計三因素三水平的響應曲面試驗（張百霞，2013）。因素及水平見表1。

表1 響應曲面優化試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對提取率的影響 由圖1可見，隨微波功率的增加，木香烴內酯和去氫木香內酯的提取率逐漸增大，當微波功率達到400 W時，二者的提取率最高，之后逐漸下降，故考慮選用400 W微波功率為宜。

圖1 微波功率對提取率的影響

2.1.2 提取時間對提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的延長，木香烴內酯和去氫木香內酯的提取率也隨之增大，在9 min時達到最大。隨著微波時間的繼續延長，提取率則有所下降。考慮選擇微波時間為9 min。

圖2 提取時間對提取率的影響

2.1.3 料液比對提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的升高，兩種成分的提取率逐漸增加，但當料液比超過1∶15（g/mL）以后，提取率又迅速下降，故選擇 1∶15（g/mL）的料液比為宜。

圖3 料液比對提取率的影響

2.2 響應曲面優化試驗 響應曲面優化試驗的取值見表2，共15個試驗點（3個中心點）用來估計試驗誤差（何力等，2010）。每次木香烴內酯和去氫木香內酯提取率見表2。

表2 響應曲面優化工藝方案及結果

2.2.1 回歸方程 利用軟件對表2的試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多元回歸方程。

提取率 （Y）/%=2.12+0.015A+3.750×10-3B+0.035C-9.804×10-4AB-0.025AC-0.017BC-0.14A2-0.10B2-0.060C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 對木香烴內酯和去氫木香內酯回歸模型進行方差分析，結果見表3。模型的P＜0.01；模型的校正確定系數R2＞0.95；料液比的一次項和三個因素的二次項對木香提取物的提取率有顯著影響（P＜0.05）；微波功率、提取時間的一次項和三個因素的交互項對兩種物質提取率的影響不顯著。

回歸模型的響應曲面見圖4。圖4a表明，當提取時間比較短時，微波功率對木香烴內酯和去氫木香內酯提取率的影響比較顯著，表現為曲線較陡；隨著提取時間的延長，微波功率增大，提取率先增高后降低。圖4b表明，兩種物質的提取率隨著微波功率和料液比的增加先快速增加，而后略有減小，等高線圖表明，兩因素的交互作用較強，影響顯著。圖4c表明，在微波時間為9～11 min、料液比為 1∶18～1∶14（g/mL）時，木香烴內酯和去氫木香內酯提取率可達到最大值。

表3 響應曲面回歸模型方差分析

圖4 兩因素交互作用對木香提取物提取率影響的響應曲面圖

2.2.3 最優工藝條件確定及驗證試驗 利用Design-Expert軟件分析提取木香烴內酯和去氫木香內酯的最優條件為：微波功率402.76 W、提取時間 9.49 min、料液比 1∶16.41（g/mL），此時模型預測木香烴內酯和去氫木香內酯的提取率為2.12%。考慮實際操作，將實驗條件修改為微波功率403 W、微波時間 9.5 min、料液比為 1∶16.5（g/mL），并在此修正條件下進行了3次平行驗證試驗，木香烴內酯和去氫木香內酯提取率的平均值為2.08%。

3 討論

在單因素試驗中，木提取物的提取率隨著微波功率的增加先增大后減少，分析可能是過高微波功率會使分子運動加劇，導致木香中所有成分的溶出均增多（董發明和白喜婷，2008），從而使木香烴內酯和去氫木香內酯所占比率下降；而提取率隨微波時間發生變化的原因可能上述相同。料液比對提取率的影響結果表明，提取率先是隨著料液比增加而提高，在超過1∶15后又有所下降，分析可能是甲醇體積的適當增加可以使木香烴內酯和去氫木香內酯更充分溶出，但當甲醇過多時，一些醇溶性雜質的溶出量也隨之增多 （朱珠和冷進松，2010），因此提取率又下降。

本試驗通過響應曲面法考察微波功率、提取時間和料液比對木香提取物提取率的影響。二次多元方程模型的回歸差異極顯著（P＜0.01）；失擬項P＞0.05，不顯著；模型的校正確定系數R2大于0.95，說明響應值的98.62%來源于所選變量，以上結果說明回歸方程擬合程度良好，可以很好地描述考察因素與響應值之間的真實關系。

在修正條件下分三次提取木香烴內酯和去氫木香內酯，實際提取率為2.08%，與預測值僅差0.04%；三次提取率的RSD為1.272%，表明利用響應曲面法得到的優化結果具有實用價值。

4 結論

微波法提取木香中木香烴內酯和去氫木香內酯的最佳工藝條件為：微波功率403 W、提取時間9.5 min、料液比 1∶16.5（g/mL）。在最佳工藝條件下的提取驗證試驗表明，木香中木香烴內酯和去氫木香內酯的提取率為2.08%。

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