熱處理對牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白及無機鹽的影響

李啟明，馬鶯，李琳，何勝華

（哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，哈爾濱150090）

0 引言

熱處理在乳的加工過程中起著很重要的作用，不僅能提高乳的加工特性，還能延長貨架期[1]。酪蛋白膠束是由酪蛋白和磷酸鹽連接的一種復合物[2]。然而，在一定溫度條件下，酪蛋白從酪蛋白膠束上解聚下來進入乳清中，同時導致酪膠束中無機鹽的變化，影響酪蛋白膠束的穩定性。

酪蛋白的解聚與乳的pH值和溫度有關，酪蛋白解聚的量隨著pH值和溫度的升高而增加[3]。目前利用RP-HPLC分析熱處理牦牛乳酪蛋白膠束上蛋白的解聚及濕法消解法/電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）測定無機鹽的變化較少，本文采用RP-HPLC分析熱處理牦牛乳酪蛋白膠束上蛋白的解聚及濕法消解法/電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）測定無機鹽的變化，探討牦牛乳在熱處理過程中酪蛋白膠束的穩定性。

1 實驗

1.1 材料

本研究所用的實驗材料是采集于四川省紅原縣的牦牛乳樣品，采集的樣品加入質量分數為0.03%的疊氮化鈉并在-18℃冷凍，并迅速送回實驗室進行牦牛乳熱穩定性的研究。

1.2 儀器設備

Agilent 1100高效液相色譜儀；全譜直讀電感耦合等離子器（Perkin-Elmer，美國）；離子色譜儀（ICS-3000，Dionex）。

2 方法

2.1 牦牛乳的熱處理

取10 mL牦牛乳于25 mL具塞試管中，于油浴鍋在120℃加熱10 min或140℃加熱2 min，邊加熱邊振蕩，加熱完成后，冷卻至室溫。

2.2 膜過濾

將熱處理和未熱處理的牦牛乳經過分子量30 ku的膜過濾，膜被固定在一個平板和框架系統里(Consep 3000系列)，利用高壓泵來提供循環的操作壓力，酪蛋白膠束被截留，乳清及乳清蛋白透過濾膜成為濾液。

2.3 乳蛋白分析

牦牛乳蛋白分析參考Li等人的方法[4]。選用Sigma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白質標準品。50 mgκ-酪蛋白 (純度 ＞80%)，125 mgαs-酪蛋白 (純度＞85%)，50 mgβ-酪蛋白 (純度＞ 90%)。牦牛乳樣品用流水解凍，于4℃下3 000×g離心10 min，去除脂肪。取1 mL牦牛脫脂乳分散到4 mL緩沖液中（濃度為8 mol/L尿素，165 mmol/L Tris，44 mmol/L檸檬酸鈉和體積分數為0.3%的二巰基乙醇）。

RP-HPLC系統：Agilent 1100。柱類型及規格：Jupiter C4 column(250 mm×4.6 mm,300A-sized pores，5-μm sized particles)。檢測波長為 220 nm，溫度為30℃，進樣量為20μL，洗脫液流速為0.8 mL/min。洗脫液：A和B兩種洗脫液，A為色譜純的水（加質量分數為0.1%的三氟乙酸），B為色譜純的乙腈（加質量分數為0.1%的三氟乙酸）。洗脫條件為：上樣前先用A液平衡，上樣后0～40 min B液濃度從30%升到50%；40～42 min B液濃度從50%升到100%；42～43 min B液濃度為100%；43～46 min B液濃度從100%降到30%，然后再用起始洗脫液洗脫5 min。總洗脫時間為51 min。分離牦牛脫脂乳中的αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La，β-Lg（A和B）。

2.4 鈣、鎂和磷元素的分析

牦牛乳中鈣、鎂和磷質量分數的分析按照Bocca等人的方法[5]。

2.4.1 濕法硝解

取待硝解樣品4.00 g于150 mL三角瓶中，加10 mL HNO3，于電熱板上徐徐加熱至濃煙冒盡后，滴加H2O2至溶液無色或微淡黃色，定容至10 mL，搖勻，靜止待測。（若硝解不徹底，可加少量高氯酸，若濃度太大，可稀釋10倍再測）

2.4.2 樣品中各元素質量分數

硝解好的樣品經美國Perkin-Elmer Optima 5 300 PV全譜直讀電感耦合等離子發射光譜儀測定樣品中各元素質量分數。

儀器工作條件：RF功率1.3 kW，等離子氣流量15 L/min，輔助氣流量0.2 L/min，霧化氣流量0.8 L/min，蠕動泵流速1.5 mL/min，樣品沖洗時間60 s，積分時間5 s，觀測方向為軸向。

2.5 磷酸鹽和檸檬酸鹽質量分數

2.5.1 離子色譜前處理

用HCL將牦牛乳原樣的pH值調至4.6，用離心機于4 000 r/min離心20 min，取上清液3 mL，用有機系0.45 um濾膜過濾，濾出液用超純水稀釋10倍，稀釋后的樣品過Diomex OnGuard RP柱除去樣品中的脂肪，去脂肪后的樣品待測。

取未熱處理樣品透過液、經120℃熱處理的樣品透過液、經140℃熱處理的樣品透過液各5 g（5 mL），在冰箱中4℃沉降10 min，取上清液3 mL，用有機系0.45 um濾膜過濾，用超純水稀釋10倍，稀釋后的樣品過Diomex OnGuard RP柱除去樣品中的脂肪，去除脂肪的樣品待測。

2.5.2 樣品中檸檬酸和磷酸鹽質量分數的測定

將前處理好的4個樣品用離子色譜儀（ICS-3000，Dionex）進行檢測，測定樣品中檸檬酸和磷酸鹽質量分數。檢測儀器工作條件：

（1）流速為1 mL/min，進樣量為100 ug，離子液為KOH，柱子為IONPAC AS11-HC，溫度為25℃。

（2）洗涮條件：0 min為 20 mmol；15 min為 30 mmol；25 min為20 mmol；30 min為20 mmol。

（3）計算公式：標樣質量濃度（10 mg/L）/標樣峰面積=樣品濃度/樣品峰面積。

3 結果與分析

3.1 不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化

牦牛乳分別經過140℃加熱2 min（120℃）加熱10 min和未加熱3種不同處理方式，將熱處理和未熱處理的脫脂乳用分子量為3×104u的膜超濾，利用RP-HPLC分析截留液中各蛋白組分的質量分數，分析不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束的解聚和乳清蛋白的變性作用。

圖1為不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化，在未熱處理時，牦牛乳中κ-CN的質量濃度為6.42 g/L，而分別經過140℃（2 min）和120℃（10 min）進行熱處理后，牦牛乳中κ-CN的質量濃度分別為4.02 g/L和4.55 g/L，熱處理后的牦牛乳酪蛋白膠束中κ-CN的質量濃度明顯低于（P＜0.05)未熱處理牦牛乳中κ-CN質量濃度，說明有部分κ-CN在熱處理情況下從酪蛋白膠束上解聚下來進入乳清中，κ-CN從酪蛋白解聚后與熱變性的乳清蛋白通過二硫鍵形成可溶性κ-CN/乳清蛋白復合物[6]。未加熱牦牛乳中αs2-CN的質量濃度為3.78 g/L，而分別經過140℃（2 min）和120℃（10 min）進行熱處理后，牦牛乳中αs2-CN的質量濃度分別為1.93 g/L和2.57 g/L，熱處理后的牦牛乳酪蛋白膠束中αs2-CN的質量濃度明顯低于（P＜0.05)未熱處理牦牛乳中αs2-CN質量濃度，說明有部分αs2-CN在熱處理情況下也從酪蛋白膠束上解聚下來進入乳清中。另外αs1-CN和β-CN也出現類似的情況。

圖1 不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化

3.2 不同熱處理牦牛乳無機鹽質量分數的變化

牦牛乳分別在140℃（2 min）和120℃（10 min）進行熱處理，分別將熱處理和未熱處理的脫脂乳用分子量為3×104u的膜超濾。表1為采用濕法消解法/電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）測定不同熱處理牦牛乳中Ca、Mg和P的質量分數。熱處理牦牛乳超濾液中的Ca質量分數比未加熱牦牛乳中Ca質量分數要低，這主要是在熱處理過程中一些游離Ca參與了乳清蛋白與酪蛋白膠束的熱誘導聚合作用，導致超濾液中Ca質量分數降低。

P也是與酪蛋白結合在一起，未加熱牦牛乳超濾液中P的質量分數比加熱牦牛乳中P的質量分數要高，可溶性P的質量分數高，牦牛乳也越穩定，牦牛乳經熱處理后，可溶性P在受熱情況下與酪蛋白發生了結合，從而降低了可溶性P的質量分數導致牦牛乳在加熱情況下變得不穩定。未加熱牦牛乳可溶性Ca/P比為0.74，而分別經140℃（2 min）和120℃（10 min）熱處理的牦牛乳的Ca/P比為1.08和1.07，因此Ca/P比較低的乳熱穩定性高。

表1 Ca，Mg和P在不同熱處理牦牛乳中的分配 mg/kg

3.3 不同熱處理牦牛乳磷酸鹽及檸檬酸鹽質量分數的變化

磷酸鹽和檸檬酸鹽也是酪蛋白膠束穩定性的重要組成成分，牦牛乳中無機鹽采用ICS-3000離子色譜測定。乳中磷酸鹽和檸檬酸鹽與Ca和Mg結合在一起。乳中可溶性檸檬酸鈣和檸檬酸鎂比磷酸鈣和磷酸鎂結合的強度高，因此在pH值恒定或變化不大時，可溶性Ca和Mg與檸檬酸直接相關。表2為磷酸鹽和檸檬酸鹽在不同熱處理牦牛乳中的分配。由表1可以看出，未加熱牦牛乳中檸檬酸鹽比加熱牦牛乳中檸檬酸鹽質量分數要高，而加熱牦牛乳酪蛋白膠束中的磷酸鹽質量分數比未加熱要高，這可能是在加熱情況下，游離的Ca與磷酸鹽一起與酪蛋白發生了結合。

表2 磷酸鹽和檸檬酸鹽在不同熱處理牦牛乳中的分配 mg/kg

4 結論

(1)利用RP-HPLC分析了不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束蛋白的變化，經過140℃（2 min）和120℃（10 min）進行熱處理后，牦牛乳酪蛋白膠束中κ-CN，αs2-CN，αs1-CN和β-CN發生了不同程度的解聚。

(2)采用濕法消解法/電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）測定不同熱處理牦牛乳中Ca、Mg和P的質量分數。熱處理牦牛乳超濾液中的Ca質量分數比未加熱牦牛乳中Ca質量分數要高，可溶性鈣高，則表現出牦牛乳由于受熱作用開始不穩定。

（3）牦牛乳中無機鹽采用ICS-3000離子色譜測定，加熱牦牛乳酪蛋白膠束中的磷酸鹽質量分數比未加熱要高，這可能是在加熱情況下，游離的Ca與磷酸鹽一起與酪蛋白發生了結合。

[1]MCKINNON I R,YAP S E,AUGUSTIN M A,et al.Diffusing-wave spectroscopy investigation of heated reconstituted skim milks containing calcium chloride[J].Food Hydrocolloids,2009，23：1127-1133.

[2]KNUIF C G,HUPPERTZ T,URBAN V S,et al(2012).Casein micelles and their internal structure[J].Advances in Colloid and Interface Science,2012：171-172,36-52.

[3]ANEMA S G，KLOSTERMEYER H.Heat-induced,pH-dependent dissociation of casein micelles on heating reconstituted skim milk at temperatures below 100℃[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45：1108-1115.

[4]LI H M,MA Y,DONG A J,et al.Protein composition of yak milk[J].Dairy Science and Technology,2010，90：111-117.

[5]BOCCA B，ALIMONTI A，CONI E，et al.Determination of the total content and binding pattern of elements in human milk by high performance liquid chromatography inductively coupled plasma atomic emission spectrometry[J].Talanta,2000，53：295-303.

[6]SINGH H，FOX P F.Heat stability of milk:pH-dependent dissociation of micellar κ-casein on heating milk at ultra high temperatures[J].Journal of Dairy Research，1985，52：529-538.