響應面法優化甘薯淀粉酶解工藝及動力學模型研究

高義霞 牛偉強 高小剛 周向軍

（天水師范學院生命科學與化學學院，天水 741001）

響應面法優化甘薯淀粉酶解工藝及動力學模型研究

高義霞 牛偉強 高小剛 周向軍

（天水師范學院生命科學與化學學院，天水 741001）

研究甘薯淀粉的α－淀粉酶酶解工藝及動力學。以葡萄糖釋放率為考察指標，研究酶解時間、酶量、淀粉濃度、pH值及酶解溫度對α－淀粉酶酶解甘薯淀粉的影響，利用單因素和響應面法優化酶解工藝。通過Lineweaver－Burk和Wilkinson統計法求解米氏常數（Km）和最大反應速度（Vm），建立相應動力學模型。結果表明：α－淀粉酶酶解甘薯淀粉最優參數為：時間40min，溫度60℃，pH 5.0，酶量0.6 U／mL和淀粉質量濃度5 mg／mL，在此條件下，驗證值為（50.676±0.294）%，n＝5，RSD＝0.519%。在 pH 6.0，50℃條件下，活化能（E a）＝31.986 kJ／moL，Km＝0.988 mg／mL，Vm＝0.107 mg／（mL·min）。

甘薯淀粉 酶解 動力學 響應面法

甘薯（Ipomoea batatas L），旋花科甘薯屬草本植物，又名山芋、紅薯、番薯等，為我國第四大農作物［1］。甘薯富含碳水化合物、蛋白質、維生素、黃酮等，具有增強免疫力和促進腸道蠕動等作用［2－3］。工業上淀粉的糖化主要有酸法和酶法，酸法易受到酸和熱的影響而發生復合反應或分解反應，分別生成異麥芽糖、龍膽二糖等低聚糖或5－羥甲基糠醛繼而生成甲酸和乙酰丙酸等，因此精制較為困難。酶法具有催化效率高、專一性強和條件溫和等特點，日益受到青睞［4］。α－淀粉酶用于水解淀粉獲取制糖、發酵行業所需的糖類原料或焙烤類食品品質的改善［5］。利用α－淀粉酶酶解谷物淀粉制備玉米蛋白、米渣蛋白和小麥麩皮蛋白已進入實踐階段［6］。實際生產中，要求準確把握酶促反應的條件以充分發揮酶的催化作用［7］。酶促反應動力學是研究酶促反應速率及其影響因素的學科，在酶的結構與功能、作用機制、反應條件及代謝作用等研究中，具有重要的理論和實踐意義［8］。影響酶解的因素主要有酶量、底物濃度、pH值、溫度和時間［9］等，李忠海等［10］考慮了酶量、時間、溫度和pH值4個因素對甘薯淀粉酶解的影響，但未考慮淀粉濃度對其他因素的交互影響，且該試驗是以酶解液中還原糖的含量為考察指標，未考慮糖化值（DE值）。隨生淀粉酶等新型淀粉酶的出現，直接選擇淀粉顆粒作為底物進行水解成為一種趨勢，因此，本試驗以葡萄糖釋放率為考察指標，探討時間、酶量、淀粉濃度、pH值和溫度對甘薯淀粉α－淀粉酶水解的影響，利用響應面法尋找最優酶解工藝，推導α－淀粉酶水解動力學模型，為甘薯淀粉工業產糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯淀粉（淀粉質量分數為66%）：北京古松經貿有限公司；α－淀粉酶（58.7 U／mg）：Sigma；酒石酸鉀鈉：中國萊陽雙雙化工有限公司；葡萄糖：天津登豐化學品有限公司。

1.2 器材

TGL－20M型高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；PHS－3D雷磁pH值計：上海精密科學有限公司；722型可見分光光度計：上海欣茂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作及甘薯淀粉的酶解

參考 3，5－二硝基水楊酸（DNS）法［11］。0.4 mg／mL葡萄糖溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加蒸餾水至2mL，混勻，加入1.5mL DNS，沸水浴加熱5min，冷卻后補至3.5mL。540 nm測定吸光值。最小二乘法擬合得標準曲線為：Y＝5.067 9X－0.052 7，R2＝0.991 6（X為葡萄糖質量／mg，Y為OD）。稱取甘薯淀粉，加一定蒸餾水攪拌10min，調至一定pH值。加一定量的α－淀粉酶液，振蕩，5min后迅速沸水滅活 5min，5 000 r／min離心 10min，測定吸收值，計算葡萄糖釋放率。葡萄糖釋放率（%）＝葡萄糖質量濃度（mg／mL）×100／淀粉質量濃度（mg／mL）。

式中：v為反應速率；m／V為葡萄糖質量濃度／mg／mL；t為反應時間／min。

1.3.2 單因素試驗

按1.3.1法，分別考察反應體系的pH值（4、5、6、7、8）、時間（5、10、20、40、80min）、溫度（30、40、50、60、70℃）、酶量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U／mL）及淀粉濃度（0.5、1、2、3、4、5 mg／mL）對葡萄糖釋放率的影響。

1.3.3 酶促反應動力學模型

Michaelis和Menten根據快速平衡學說建立米氏方程，Briggs和Haldane用穩態代替快速平衡態，對米氏方程做了修正，得到更合理的酶促反應動力學過程。推導過程簡述如下［12］：

式中：k1為ES生成速率；k2、k3分別為ES分解為E＋S和P＋E的速率；k4為E＋P生成ES的速率（反應初期忽略不計）。［S］為底物質量濃度／mg／mL；E總（U／mL）＝［E］＋［ES］。將（6）線性化處理，得Lineweaver－Burk方程，求 Km和Vm；利用Wilkinson統計法求

1.3.4 響應面法優化酶解工藝

在單因素試驗的基礎上，以酶量、時間、溫度、淀粉濃度和pH值為因子，單因素試驗各因子最優點為基準點，確定適度步長，葡萄糖釋放率為響應值，利用Design－Expert8.06中Box－Behnken法設計五因素三水平響應面優化方案［14］，見表1。

表1 Box－Benhnken試驗因素水平及編碼

1.4 數據處理

利用origin7.5作圖，Design－Expert 8.06進行響應面分析，單因素方差分析采用 Excel 2003（P＜0.05），數據重復3次，以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1a可知，葡萄糖釋放率對pH變化曲線為鐘罩形曲線（P＜0.01），在pH 4.0～6.0范圍內，葡萄糖釋放率逐漸增大，pH 6.0時達最大值，說明此時酶的解離狀態最有利于與底物結合［15］。在pH 6.0～8.0范圍內，釋放率逐漸降低，原因是過酸或過堿破壞鹽鍵，使酶活性中心空間構象發生改變而失活。同時，pH值影響酶分子及淀粉分子的解離程度，從而影響酶的穩定性及與底物的結合，進而影響酶的催化作用和反應速度［16－17］，因此選擇 pH 6.0。由圖 1b可知，隨酶量的增加，葡萄糖釋放率增大（P＜0.01），這是因為反應起始時淀粉過量，酶量與酶促反應速率成正比，隨酶量的進一步增加，葡萄糖釋放量逐漸受淀粉濃度的限制，曲線上升平緩甚至下降［18］，此時繼續增大酶量對反應速率影響不大［19］，故酶量選擇0.5 U／mL。由圖1c可知，隨時間的延長，葡萄糖釋放率先急劇增大，隨后緩慢并趨于穩定（P＜0.01），原因是部分葡萄糖重新結合生成異麥芽糖等復合糖，同時，淀粉濃度降低、產物濃度增加加速了逆反應的進行、產物對酶的抑制作用和隨時間的延長酶分子失活等［20］。綜合考慮葡萄糖釋放率及生產周期等因素，選擇60min。由圖1d可知，溫度與釋放率曲線為鐘罩形（P＞0.05），在30～50℃范圍時，隨溫度的增加，釋放率增加，50℃達最大值。隨后繼續增大溫度，釋放率下降。因此，溫度選擇50℃。由圖1e可知，隨淀粉濃度的不斷增加，葡萄糖釋放率逐漸減少（P＜0.01），與張國權等［20］研究結果一致。當淀粉濃度較低時，雖然葡萄糖釋放率相對較大，但此時酶遠未被底物飽和，催化效率相對較低，且淀粉濃度較低時誤差較大，故實踐意義不大，不予考慮。結合下文可知，淀粉質量濃度為2～4 mg／mL時，底物達到飽和狀態，酶促反應速度達到最大，綜合考慮，淀粉質量濃度選擇4 mg／mL。

圖1 單因素試驗

2.2 響應面分析

Box－Benhnken設計和結果見表2。對表2數據回歸擬合，Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋0.42X3＋8.61X4＋1.06X5－2.71X1X2＋0.20X1X3－0.28X1X4－1.33X1X5＋0.42X2X3－2.91X2X4＋1.08X2X5＋0.947，說明響應值的變化有94.7%來自所選變量。失擬項P值為0.364，大于0.05，該模型失擬項不顯著，因此方程可用來解釋結果并預測最佳工藝條件。方差分析及系數顯著性檢驗分析見表3。方差分析表明，方程具有顯著性（P＜0.01）。淀粉濃度（X4）和酶量（X1）“Prob＞F”值 ＜0.01，表明其對葡萄糖釋放率的影響極顯著；時間（X2）和 pH（X5）的“Prob＞F”值 ＜0.05，影響顯著；溫度（X3）的“Prob＞F”值 ＞0.05，影響不顯著。各因素影響大小依次為淀粉濃度、酶量、時間、pH值、溫度。二次項影響顯著，交互項影響大小依次為 X2X4、X1X2、X3X5、X1X5、X2X5、X3X4、X2X3、X4X5、X1X4、X1X5，其中 X1X2、X2X4達到極顯著水平，其他均不顯著，表明各因素對葡萄糖釋放率的影響不是簡單線性關系。去掉不顯著因素，模型為Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋8.61X4＋（9）。最優工藝為：酶量 0.6 U／mL，時間 40min，溫度58.97℃，淀粉質量濃度5 mg／mL和pH 5.26，預測葡萄糖釋放率可達52.5%。為了操作的方便，調整為：酶量0.6 U／mL，時間40min，溫度60℃，淀粉質量濃度5 mg／mL和 pH 5.0。試驗平均值為（50.676±0.294）%（n＝5），RSD＝0.519%，相對誤差為（2.91%～4.03%）＜5%，表明模型有效。與其他薯類的α－淀粉酶酶解相比較，葡萄糖釋放率較低，其原因是酶解前未對淀粉進行糊化處理，另一方面與淀粉分子中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例、顆粒大小、形狀、結晶結構和結晶度等有關［21］。

表2 Box－Benhnken試驗設計表及結果

表3 回歸方程方差分析表

2.3 Lineweaver－Buck法求解參數

由圖2a可知，在淀粉濃度較低時，酶未被底物飽和，反應速率與淀粉濃度呈正比關系，表現為一級反應；隨后繼續增大淀粉濃度，反應速率不再呈正比增加，表現為混合級反應；當淀粉濃度增至相當高時，淀粉濃度對反應速率影響變小，平衡時達到最大反應速率，表現為零級反應，這表明甘薯淀粉的酶解遵循米氏酶中間絡合物學說，可用米氏方程進行擬合。根據式（7），以1／v對 1／［S］作圖，見圖 2b。求得 Km＝1.742 mg／mL，Vm＝0.143 mg／（mL·min）。α－淀粉酶酶解甘薯淀粉方程為R＝0.996，方程極顯著。

圖2 淀粉濃度與反應速率的關系

表4 Wilkinson統計法求估算解

表5 Wilkinson法精校解

2.4 Wilkinson統計法求解參數

2.4.1 最小二乘法求估算解

由表4可知，Δ＝αε－γδ＝0．000 000 007 95，式中分別為最大反應速度和米氏常數估算值。

2.4.2 泰勒展開式求精校解

由表5知，Δ′＝α′β′－γ′2＝0．000 011，b1＝（β′δ′－γ′ε′）／Δ′＝1．05；b2＝（α′ε′－γ′δ′）／Δ′＝0．133。得精確解；式中b1和b2分別為 Vm和 Km計算過程中修正常數。

2.4.3 Lineweaver－Buck法和Wilkinson統計法的比較

由表6可知，Lineweaver－Buck法和 Wilkinson統計法計算得到的Vm和Km有一定的差別。這是因為前者的試驗點過分集中在直線左下方原點處，在淀粉濃度很低時，其取倒數后誤差較大，往往偏離直線較遠。［S］適合范圍一般為在0.33～2 Km，因此，即使采用最小二乘法線性回歸分析，也將影響Km和Vm的準確性［8，10］，但該法方便快速，計算量小。Wilkinson統計法被認為計算結果可靠，但過程冗余且復雜［22］。經上述分析比較，試驗最終采用Wilkinson統計法求解結果，即 Vm＝0.107 mg／（mL·min），Km＝0.988 mg／mL。α－淀粉酶酶解甘薯淀粉的動力學方程為

表6 Lineweaver－Buck法和Wilkinson統計法數據比較

2.5 E a計算

在30～50℃范圍內，反應速率隨溫度的增加而增大，以 ln v對1／T（×103）作圖，呈直線關系，用阿累尼烏斯（Arrhenius）方程擬合：

式中：R為氣體常數 8.31 J／（mol·K）；E a為活化能／kJ·mol；B為積分常數。

將式（11）寫成指數形式，K3＝A×exp（－E a／RT），A為前指因子／mg／（mL·min）?；貧w方程為Y＝8.926－3.849X，R＝0.989，得 E a＝31.986 kJ／mol，A＝7 522.396 mg／（mL·min），R＝0.989，表明Arrhenius方程對該數據的擬合是極顯著的。

3 結論

利用響應面法優化α－淀粉酶酶解甘薯淀粉，對酶解動力學進行研究。結果表明：酶解模型為：Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋8.61X4＋1.06X5－2.71X1X2－最佳酶解工藝為：酶量0.6 U／mL，時間40min，溫度60℃，淀粉質量濃度5 mg／mL和 pH 5.0，驗證值為（50.676±0.294）%（n＝5），RSD＝0.519%。在 pH 6.0，50℃條件下，E a＝31.986 kJ／moL，Km＝0.988 mg／mL，Vm＝0.107 mg／（mL·min）。

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Enzymolysis Technology of Sweet Potato Starch by Response Surface Method and Its Kinetic Modeling

Gao Yixia Niu Weiqiang Gao Xiaogang Zhou Xiangjun

（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001）

To study enzymolysis technology of sweet potato starch and its kinetic modeling，the releasing rate of glucose was taken as an index，and the effects of hydrolysis time，enzyme adding amount，starch concentration，pH and hydrolysis temperature of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch have been explored.Single experiment and response surfacemethod have been applied to optimize enzymolysis.At the same time，Michaelis constant（K m），maximum velocity（V m）and corresponding kinetic equation were also calculated by Lineweaver－Burk Plotting and Wilkinson StatisticalMethod.The results showed that the optimal enzymolysis parameterswere 40min，60℃，pH 5.0，enzyme adding amountof0.6 U／mL，and starch concentration of5mg／mL.On this conditions，verification value was（（50.676±0.294）%，n＝5），RSD＝0.519%.At pH 6.0 and 50℃，E a＝31.986 kJ／moL，Kmand Vmwere 0.988 mg／mL and 0.107 mg／（mL·min）respectively.

sweet potato starch，enzymatic hydrolysis，kinetic，response surfacemethod

TS201.1

A

1003－0174（2015）06－0043－06

天水師范學院“青藍”工程人才基金（TS201406）

2014－01－21

高義霞，女，1982年出生，碩士，食品化學

周向軍，男，1980年出生，講師，食品酶學