腫瘤血管抑制劑DX-1002結構的NMR確證

陳芙蓉，寧 欣，張玉霞，李 丹，林 潔，雍智全，徐小平

（1.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2.東莞達信生物技術有限公司，廣東 東莞 523808）

0 引 言

DX-1002 的化學名為（E）-3-（3″-羥基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基）丙烯酸正丁銨鹽，分子式為：C23H31NO7；分子量為 433.21，是 Compretastatin類化合物的新衍生物，其化學結構如圖1所示。

Compretastatin類化合物是Petti小組等從南非Combretum caffrum樹干中提取分離的具有抗腫瘤活性的二苯乙烯類化合物[1-3]。與傳統的直接作用于癌細胞靶點的細胞毒類化療藥不同，Compretastatin類化合物可靶向作用于腫瘤的血管，引起內皮細胞在形態學上的改變，從而阻塞腫瘤微血管，達到抑制腫瘤的目的[3-9]。目前，同類型的化合物已有CompretastatinA-4P（CA4P）作為前體藥物進入臨床II-III期試驗[2]。然而，這類化合物最大的缺陷是母體結構，即CA4的溶解性極差，雖然經磷酸酯化后以二鈉鹽的形式增加了水溶性，但是磷酸鹽的引入不僅可能帶來一定的不良反應，而且降解后的母體溶解性同樣低，嚴重限制了CA4P向其他口服劑型開發的可能，僅能成為靜脈注射劑。為此，DX-1002在研發時著重解決了本類化合物的溶解性問題，以溶解性更好的銨鹽替代了CA4P的前體結構，不僅藥理活性更優且毒副反應更低。由于增加了活性母體的溶解性，使DX-1002化合物適合于制備各種劑型，特別是口服制劑，成為一個極具開發價值的腫瘤血管靶向抑制劑。為了明確本品化學結構，本文擬采用NMR技術檢測DX-1002的NMR譜，同時結合本品質譜和紅外光譜吸收等特征光譜的驗證[10]，首次解析了本品的化學結構。

圖1 DX-1002的結構圖

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀（美國瓦里安公司）；布魯克道爾頓Bio-TOF Q質譜儀（美國布魯克-道爾頓儀器公司）；意大利CARLO ERBA 1106元素分析儀（意大利）；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀（美國Nicolet儀器公司）。

1.2 試 劑

氘代水（D2O）：NMR專用試劑。

1.3 樣 品

DX-1002精制品的批號為010203，含量≥99.75%（HPLC法），購于東莞安好醫藥科技有限公司。

2 核磁共振譜

2.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）

根據氫譜（見圖2），結合gCOSY譜，對樣品DX-1002各個氫原子的1H譜進行歸屬：

1）在1H-MNR譜中，共有11組峰，從低場到高場積分比為 3∶2∶2∶2∶9∶3∶2∶1∶1∶1∶1，DX-1002 分子結構中的27個質子在圖譜上體現，4個活潑氫被氘代。

2）δ0.832為一組二重峰，質子數為3，同時gCOSY譜顯示，該質子與b-H質子相關，推測為a-CH3；δ1.329為一組二重峰，質子數為2，gCOSY譜顯示，該質子除與a-H質子相關外，還與c-H相關，推測為b-CH2；δ1.546為一組二重峰，質子數為2，gCOSY譜顯示，該質子與b-H質子和d-H質子相關，推測為c-CH2；δ2.914為一組二重峰，質子數為2，該質子與c-H質子相關，推測為d-CH2。由此，可以推斷這4組質子為正丁基上的質子。

3）δ3.593為一組二重峰，質子數為 9，gCOSY 譜顯示，該質子與 4″-OCH3和 2′，6′-H 質子相關，推測為 3′，4′，5′-OCH3；δ3.749 為一組二重峰，質子數為 3，gCOSY 譜顯示，該質子與 3′，4′，5′-OCH3和 5″-H 質子都相關，推測為4″-OCH3。這兩組甲氧基上的質子相互影響，以致在圖譜中出現了一個又強又復雜的多峰體系，與DX-1002的化學結構相符。

4）δ6.375為一組單峰，此峰尖銳，質子數為 2，gCOSY 譜顯示，該質子與 3′，4′，5′-OCH3質子和6″-H質子相關，推測為 2′，6′-H，與 DX-1002 的結構相符。

圖2 DX-1002的1H-NMR譜

5）δ6.386為一組單峰，質子數為 1，gCOSY 譜顯示，該質子與3-H質子和6″-H質子具有相關性，推測為 2″-H。

6）δ6.462為一組二重峰，質子數為 1，gCOSY 譜顯示該質子與 2′，6′-H 質子和 5″-H 質子相關，推測為 6″-H。 δ6.499為一組二重峰，質子數為 1，gCOSY譜顯示，該質子與4″-OCH3質子和6″-H質子相關，推測為 5″-H。δ7.346為一組單峰，質子數為 1，gCOSY譜顯示，該質子與2″-H和6″-H相關，推測為3-H。

由上述解析綜合可得出DX-1002結構中所有氫原子的歸屬：δ0.832（d，3H，a-CH3），δ1.329（d，2H，b-CH2），δ1.546（d，2H，c-CH2），δ2.914（d，2H，d-CH2），δ3.593（d，9H，3′，4′，5′-OCH3），δ3.749（d，3H，4″-OCH3），δ6.375（s，2H，2′，6′-H），δ6.386（s，1H，2″-H），δ6.462（d，1H，5″-H），δ6.499（d，1H，6″-H），δ7.346（s，1H，3-H）；另外還有4個活潑氫，在圖譜中未能表現出來，在D2O中被D氫取代。該信號歸屬符合DX-1002的化學結構。

1.2 核磁共振碳譜（13C-NMR）

1）以重水為溶劑測得13C-NMR的圖譜（見圖3）中，共有21組峰：其中DEPT圖譜表現出伯碳有4組共5個碳原子；仲碳有3組共3個碳原子；叔碳有5組共6個碳原子；季碳有8組共為9個碳原子的峰。故樣品中共有23個碳原子，這與DX-1002的分子式相符。

2）δ15.103為伯碳峰，且在gHMQC譜上顯示與a-CH3的質子近程相關，在gHMBC譜上顯示與b-CH3，c-CH3的質子遠程相關，故可推定為 a-CH3；δ21.34，δ31.101，δ41.526 均為烷烴仲碳，根據 DX-1002 的結構可推定其分別為 b-CH2，c-CH2，d-CH2。確定這 4 個碳原子構成正丁基（C4H9-）。

3）δ57.788 為伯碳峰，且與 4′-OCH3上的質子近程相關，與4″-OCH3的質子遠程相關，推測為4′-OCH3上的伯碳原子；同時δ58.186為二重峰，表示有兩個伯碳原子，且與 3′，5′-OCH3的質子近程相關，與 4″-OCH3上的質子遠程相關，推測為 3′，5′-OCH3的 2 個伯碳原子；同理，δ63.341為4″-OCH3上的伯碳原子。

4）δ109.224為叔碳峰，峰高且尖，為二重峰，與芳環2′，6′-H上的質子存在近程相關，與3-H的質子遠程相關，推定此碳為芳環2′，6′的二個叔碳原子。

5）δ113.626 為叔碳峰，其與 5″-H 位上的質子近程相關，與6′-H上的質子具有遠程相關性，推定為5″-C。

6）δ118.900為叔碳峰，與2″-H的質子近程相關，與3-H和6′-H的質子具有遠程相關性，推定為2″-C。

7）δ125.518為叔碳峰，與6″-H的質子近程相關，與5″-H的質子存在著遠程相關性，推定其為6″-C。

8）δ130.918 為季碳峰，只與 2″，6″-H 的質子存在著遠程相關性，推定其為1″-C。

9）δ137.718為叔碳峰，與3-H的質子有近程相關；δ137.812為季碳峰，只有與3-H的質子存在遠程相關，推測為C=C上的兩個碳原子，即3，2-C。

10）δ138.175為季碳峰，其與多組質子峰存在著遠程相關性，故推定為1′-C。

11）δ139.29 為季碳峰，只與 4′-OCH3上的質子存在遠程相關性，推測為4′-C。

12）δ146.588 為季碳峰，只與 2″-H 的質子有遠程相關性，推測為 3″-C。

13）δ149.858 為季碳峰，只與 5″-H 的質子有遠程相關性，推測為 4″-C。

14）δ154.930為季碳雙峰，符合這一特性的只有苯環上的 3′，5′-C。

圖3 DX-1002的13C-NMR譜

15）δ178.099為季碳峰，沒有近程相關的氫，只與3-H質子具有遠程相關性，推測為1-C。

綜上所述，13C譜的信號歸屬如下：

δ15.103（a-CH3），δ21.34（b-CH2），δ31.101（c-CH2），δ41.526（d-CH2），δ57.788（4′-OCH3），δ58.186（3′，5′-OCH3），δ63.341（4″-OCH3），δ109.224（2′，6′-C），δ113.626（5″-C），δ118.900（2″-C），δ125.518（6″-C），δ130.918（1″-C），δ137.718（3-C），δ137.812（2-C），δ138.175（1′-C），δ139.29（4′-C），δ146.588（3″-C），δ149.858（4″-C），δ154.930（3′，5′-C），δ178.099（1-C）。

1.3 順反異構體結構的鑒定

根據本品1H譜、gCOSY、gHQMC和NOESY譜的數據比較和解析，對分子中順反異構進行了判斷。

1）在 gCOSY 譜中可以看到 2′，6′-H 與 6″-H 也具有相關性，證明了 2′，6′-H 與 6″-H 在空間位置上是相接近的，即 2′，6′-H 所在的苯環與 6″-H 所在的苯環在烯烴雙鍵的同側。

2）由gHMQC譜可知，1-C與3-H具有遠程相關性，說明1-C和3-H在烯鍵的同側。

3）由 NOESY 譜中可看出，3-H 與 2″-H 和 6″-H具有相關性，說明3-H與2″-H和6″-H在空間位置上很接近，即3-H與2″-H和6″-H所在的苯環連在同一個烯烴碳原子上。

1）2）3 ）的譜圖結果顯示本結構中的烯鍵符合反式烯烴（E）的結構特征。

由以上的NMR數據可知，本品與DX-1002的化學結構一致。

2 元素分析

元素分析的結果表明本品H為7.13%，C為60.80%，N為2.86%，與分子式C23H31NO7理論值（C：63.76%，H：7.21%，N：3.23%）相符合。

3 質譜（ESI-MS）

ESI+質譜的質荷比434.16與本品的分子離子峰[M+H]相符；質荷比 361.12 與其[M-NH2（C4H9）+H]的碎片離子相符；質荷比 794.28 為[2M-NH2（C4H9）+H]的碎片峰，質荷比 776.31 為[2M-NH2（C4H9）-OH+H]的碎片峰，由此進一步證明本品分子式為C23H31NO7，分子量為433.21，化學結構與圖1的化學結構的一致性。

4 紅外吸收光譜（IR）

紅外吸收光譜的特征吸收3 516.47，3 384.46，1580.01，1552.05cm-1體現出分子中的胺基的存在，2960.07，2847.16cm-1為甲基，2938.54，2839.19cm-1為亞甲基；3167.50，3066.01cm-1為甲氧基，1233.63，1124.66 cm-1為苯環C-O-C，說明本品中有-OCH3連接在苯環上；1 632.45，1 508.69 cm-1為-C=C-，972.56 cm-1為乙烯基中=CH，904.85，872.63cm-1為苯環上的=CH，說明本品結構中有-C=CH和苯環；1459.37，1355.95cm-1為羧C=O，說明結構中有-COOH。由此，證明本品的結構中存在了-NH2，-CH3，-CH2CH3，-OCH3，苯環，CH=CH，C=O等基團。

5 結束語

綜上所訴，根據DX-1002的NMR譜結果，同時結合DX-1002質譜碎片特征、IR光譜特征和元素分析，證明 DX-1002 的化學結構為（E）-3-（3″-羥基-4″-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧基苯基） 丙烯酸正丁銨鹽，分子式為C23H31NO7，分子量為433.21。

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