金銀花葉抑菌成分的提取及效果研究

李世傳，杜華英，熊建華，*，湯凱潔，吳國平，吳磊燕

（1.江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045；2.雙胞胎集團研發中心，江西南昌330096）

金銀花葉抑菌成分的提取及效果研究

李世傳1，2，杜華英1，熊建華1，*，湯凱潔1，吳國平1，吳磊燕1

（1.江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045；2.雙胞胎集團研發中心，江西南昌330096）

研究金銀花葉抑菌成分的最佳提取工藝和抑菌效果。以抑菌圈大小為評價指標，通過比較普通回流、超聲提取、索氏提取三種方法的效果確定相對較佳提取方法，并在單因素的基礎上采用正交試驗優化提取工藝，采用梯度稀釋法測定提取物的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。結果表明，最佳提取工藝為采用普通回流提取，溫度為70℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶15 g/m L的條件下提取時間1.5 h，金銀花葉乙醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為500μg/g和250μg/g，MBC分別為1 000μg/g和500μg/g。結論：采用普通回流提取法能較好地提取金銀花葉抑菌活性成分，工藝穩定、可行。

金銀花葉；抑菌活性成分；提取工藝；抑菌效果

植物資源的綜合利用是近年開發研究的重點，如何最大限度地獲取植物中的有效成分是提高植物綜合利用的基礎和保障[1-2]。金銀花（Lonicera Japonica Thunb），又名忍冬，為忍冬科植物，是我國傳統的中藥材，具有抗菌消炎、清熱解毒、涼散風熱、抗病毒、保肝利膽等功能[3-5]。其葉片產量較高，資源豐富，同時有很多研究表明葉中富含綠原酸、黃酮等多酚類物質，抑菌、抗氧化等藥理活性較好，特別在抑菌方面與花的相同甚至高于花[6-9]。然而有關金銀花葉抑菌有效成分的優化提取卻鮮有報道，本文以金銀花葉為原材料，以典型的革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為指示菌，研究了金銀花葉抑菌活性物質的提取方式和提取工藝條件，同時探討了金銀花葉乙醇提取物的最低抑菌和殺菌濃度，以期為金銀花葉資源的開發利用提供一定的參考。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

金銀花葉，采自江西南昌梅嶺，江西中醫學院鄒嘉玉鑒定，陰干，粉碎，待用。

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），江西農業大學微生物實驗室提供。

1.1.3 主要試劑

無水乙醇、氯化鈉：分析純，天津永大化學試劑有限公司；蛋白胨、牛肉膏：生物試劑：北京奧博星生物技術有限責任公司，等。

1.1.4 主要儀器

HH4-數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RE-5旋轉式蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1冷凍干燥機：北京博醫康技術公司；DHP120恒溫培養箱：上海躍進醫療機械廠；LDZX-40B電熱蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療機械廠等。

1.2 方法

1.2.1 提取方式的選擇

取金銀花葉粉末10 g9份，用60%的乙醇作為提取劑，料液比為1∶15 g/mL，溫度60℃，分別采用普通回流提取、超聲提取和索氏提取，提取后真空抽濾，濾渣再以相同的條件提取一次。合并兩次提取液，用旋轉式蒸發儀真空濃縮，冷凍干燥得到普通回流提取物、超聲提取物、索氏提取物。

將3種方式提取物進行抑菌試驗，比較提取效果。

1.2.2 金銀花葉提取工藝單因素試驗

金銀花葉含有豐富的酚酸、黃酮等多酚類活性物性，是抑菌、消炎等多種活性的功能成分，乙醇價廉易得、無毒、選擇性好，極性較高，為多酚類較好的提取劑，選擇乙醇溶液提取金銀花葉抑菌活性成分。

分別以乙醇體積分數（0、20、40、60、80、100）、提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）、提取溫度（25、40、55、70、85、100℃）和料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL）為單因素，考察各因素對金銀花葉提取物抑菌效果的影響。

1.2.3 金銀花葉提取正交試驗

根據單因素試驗結果，綜合考慮乙醇體積分數、提取時間、提取溫度和料液比對提取效果的影響，安排L9（34）正交試驗見表1，以確定最佳的提取參數。

表1 正交試驗因素水平表Table1 The factors and Levels for the orthogonal test

1.2.4 驗證試驗

取金銀花葉粉末10 g，在正交試驗獲得的最佳工藝條件下進行提取，提取物進行抑菌試驗，重復三次。

1.2.5 抑菌試驗方法

牛肉膏蛋白胨培養基的配制[10]：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂17 g～20 g，蒸餾水1 000mL，用1mol/L的氫氧化鈉調pH至7.4左右。

將供試菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）在斜面培養基上活化，活化后用無菌水洗脫配制成含菌數約為1×106CFU/mL的菌懸液。往無菌培養皿內倒入約15mL的培養基，冷卻后往培養基內加入供試菌懸液0.2mL，用涂布器涂布均勻，制成含菌平板。樣品配成濃度為0.1 g/mL，往滅菌的濾紙片（直徑為12mm）上滴加20μL的供試樣品，待其干燥后貼入含菌平板中，每皿一片，放入培養箱中培養培養24 h，培養溫度為（37±1）℃。每個樣品做3次重復，培養后測量濾紙片抑菌圈的大小，抑菌圈越大，表示抑菌效果越好[11-12]。

1.2.6 金銀花葉乙醇提取物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

將金銀花葉乙醇提取物標準液用無菌水配制成2 000、1 000、500、250、125、62.5和31.25μg/g的濃度系列，依次各取1mL注入已滅菌的液體培養基中，分別向試管中準確注入0.1mL的濃度約為1×106CFU/ mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液，另設對照組。將所有試管放于36℃中培養24 h～48 h，在黑色背景下進行觀察，有細菌生長的呈渾濁，未見渾濁的則為無菌生長。取上述藥物最低抑菌濃度以上未見細菌生長的各試管培養物0.1mL，移接至不含藥物的無菌瓊脂培養基上，用涂布器將藥液涂勻，放在37℃恒溫培養箱中培養24 h～48 h，觀察是否有細菌生長，平皿培養基中，少于5個菌落的最低藥物溶度就是該藥物的最低殺菌濃度（MBC）[13-15]。

1.2.7 統計方法

2 結果與討論

2.1 提取方式的選擇

3種不同方式提取金銀花葉抑菌成分的抑菌效果如表2所示。

表2 金銀花葉不同提取方式提取物的抑菌作用Table2 The antimicrobial effect of different method extract from the Lonicera Japonica leaves mm

由表2可知3種提取方式所得提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑菌效果且對大腸桿菌的抑制效果較金黃色葡萄球菌要差。超聲提取和索氏提取的效果略好于普通回流提取，但由于超聲提取需要有較大的超聲設備，索氏提取提取量少、速度慢等缺點，而普通回流提取操作簡單，使用方便，提取量大，并且其效果和前兩者相差不大，因此選擇普通回流提取作為試驗的提取方式。

2.2 金銀花葉乙醇溶液提取單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對金銀花葉提取物抑菌效果的影響

不同乙醇體積分數提取金銀花葉抑菌效果的影響如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數對金銀花葉乙醇提取物的抑菌效果的影響Fig.1 The effect of concentration of ethanol on antibacterial activities

由圖1可知當乙醇體積分數小于60%時，金銀花葉乙醇提取物的抑菌效果不斷增強，當乙醇體積分數大于60%時抑菌效果會減弱，乙醇體積分數為60%時抑菌效果最好。表明在一定范圍內提高乙醇體積分數有利于抑菌物質的提取，濃度過高反而不利于抑菌物質的提取。

2.2.2 提取時間

提取時間對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著提取時間的增加，金銀花葉提取物的抑菌效果不斷增強，但到2 h之后抑菌效果增加緩慢。為了節約時間而又使金銀花葉抑菌物質充分提取，可選擇2 h作為最佳條件。

圖2 提取時間對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果Fig.2 The effect of time for extraction on antimicrobial activities

2.2.3 提取溫度

提取溫度對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果的影響如圖3所示。

圖3 溫度對金銀花葉乙醇提取物的抑菌效果的影響Fig.3 The effect of temperature on antimicrobial activities

由圖3可知，在提取溫度小于70℃時，金銀花葉乙醇提取物抑菌效果不斷增強，溫度大于70℃后則相反，在70℃時抑菌效果最好。說明在一定范圍內溫度越高，越有利于金銀花葉抑菌活性物質的提取。這是由于在一定溫度范圍內溫度升高，分子運動加快，有利于分子的擴散，使得活性物質；但當溫度過高時，可能會將金銀花葉中的某些抑菌活性成分破壞，故反而不利于抑菌活性物質的提取。

2.2.4 料液比

不同料液比對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果的影響如圖4所示。

圖4 料液比對金銀花葉乙醇提取物的抑菌效果的影響Fig.4 The effect of proportion of solid to liquid on antimicrobial activities

圖4 顯示，料液比對金銀花葉乙醇提取物的抑菌作用呈先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶25 g/mL時抑菌效果到達最大。料液比1∶25g/mL時的抑菌效果與1∶20g/mL時的抑菌效果相差不大，從減少濃縮時間和節約乙醇用量等方面綜合考慮，料液比1∶20g/mL更為合理科學。

2.3 金銀花葉提取正交試驗結果

金銀花葉乙醇溶液提取正交試驗結果、極差及方差分析如表3、表4、表5、表6和表7所示。

表3 金銀花葉乙醇提取物正交試驗結果Table3 The results of orthogonal design test

表4 金銀花葉乙醇提取物對大腸桿菌抑制效果的極差分析Table4 The Poor analysis of antimicrobial activities to Escherichia coli

表5 乙醇提取物對大腸桿菌的抑制效果正交試驗方差分析表Tab le5 Analysis of variance of antimicrobial activities to Escherichia coli

表6 金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果極差分析Table6 The Poor analysis of antimicrobial activities to Staphylococcus aureus

表7 乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果的正交試驗方差分析表Table7 Analysis of variance of antimicrobial activities to Staphylococcus aureus

金銀花葉乙醇提取物對大腸桿菌的正交數據表3及極差分析表4顯示各因素對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果的影響程度為A＞B＞C＞D。表5方差分析結果可知，各因素對測定結果差異極顯著（p＜0.01）。綜合極差分析和方差分析，金銀花葉乙醇提取物對大腸桿菌抑制效果的最佳提取工藝為A3B2C1D1，即在提取溫度為70℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶15 g/mL和提取時間為1.5 h條件下，對金銀花葉進行提取，其提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果的正交數據表3極差分析表6顯示各因素對金銀花葉乙醇提取物抑菌效果的影響程度為A＞B＞C＞D。由表7方差分析結果可知，提取溫度和乙醇體積分數各水平間差異極顯著（P＜0.01），料液比和提取時間各水平差異不顯著（P＞0.05）。綜合極差分析和方差分析，金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果的最佳提取工藝為A3B2C1D1，即在提取溫度為70℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶15g/mL和提取時間為1.5 h條件下，對金銀花葉進行提取，其提取物抑菌效果最好。這與金銀花葉乙醇提取物對大腸桿菌的抑制效果的最佳工藝相一致。

按照正交試驗得出的最佳提取工藝條件，即提取溫度為70℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶15 g/mL和提取時間為1.5 h條件下提取金銀花葉抑菌活性成分，提取物進行抑菌試驗，重復3次，得到對大腸桿菌的抑菌圈為（15.8±0.2）mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為（16.9±0.17mm），與正交試驗最佳工藝組數據吻合，表明該最佳工藝提取金銀花葉抑菌活性成分抑菌效果好，工藝穩定。

2.4 金銀花葉乙醇提取物的最低抑菌濃度（MIC）

金銀花葉乙醇提取物對供試菌的最低抑菌濃度如表8所示。

從表8中可知，金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡

表8 金銀花葉乙醇提取物對供試菌的最低抑菌（M IC）濃度Table8 TheM IC of extract from Lonicera Japonica Thunb leaves

萄球菌的最低抑菌濃度為250μg/g，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為500μg/g。

2.5 金銀花葉乙醇提取物的最低殺菌濃度（MBC）

金銀花葉乙醇提取物對供試菌的最低抑菌濃度如表9所示。

表9 金銀花葉乙醇提取物對供試菌的最殺抑菌（MBC）濃度Table9 The MBC of extract from Lonicera Japonica Thunb leaves

從表9中可知，金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度（MBC）為500μg/g，對大腸桿菌的最低殺菌濃度（MBC）為1 000μg/g。

3 結論

1）金銀花葉抑菌成分的3種提取方式所得提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑菌效果，綜合考慮各方面因素，采取普通回流提取更合理。

2）通過單因素和正交試驗優化，金銀花抑菌成分提取的最佳工藝為：A3B2C1D1，即在提取溫度為70℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶15 g/mL和提取時間為1.5 h，工藝穩定，結果可信。

3）金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為250μg/g，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為500μg/g。

4）金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度（MBC）為500μg/g，對大腸桿菌的最低殺菌濃度（MBC）為1 000μg/g。

5）金銀花葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果好與對大腸桿菌的抑制效果。

[1]Bin Shan,Yi-Zhong Cai.The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts[J].International Journal of Food Microbiology,2007,117(1)：112-119

[2]Jianhua Xiong,Shichuan Li,Wenjun Wang,et al.Screening and identification of the antibacterial bioactive compounds from Lonicera japonica Thunb.Leaves[J].Food Chemistry,2013,138(1)：327-333

[3]Chidananda Swamy Rumalla.Quantitative determination of phenolic acids in Lonicera Japonica Thunb using high performance thin layer chromatography[J].Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2010,34(1)：38-47

[4]李世傳,熊建華,羅秋水,等.不同干燥方法對金銀花葉成分和抑菌效果的影響[J].中國食品學報,2012,12(12)：78-83

[5]Atiqur Rahman,Sun Chul Kang.In vitro control of food-borne and food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb[J].Food Chemistry,2009,116(3)：670-675

[6]Eun Ju Lee,Ju Sun Kim,Hyun Pyo Kim,eta1.Phenolic constituents from the flower buds of Lonicera japonica and their 5-lipoxygenase inhibitory activities[J].Food Chemistry2010,120(1)：134-139

[7]On Nuri Seo,Gon-Sup Kim,Semin Park,et a1.Determination of polyphenol components of Lonicera japonica Thunb.using liquid chromatography-tandem mass spectrometry：Contribution to the overall antioxidant activity[J].2012,134(1)：572-577

[8]郭玉,陽育聰,劉運美.金銀花及其葉中有效成分的比較研究[J].南華大學學報：醫學版,2008,36(2)：154-157

[9]孫德梅.金銀花葉提取物的抗氧化活性和抑菌作用研究[J].河南科學,2002,20(5)：511-513

[10]黃秀梨.微生物學實驗指導[M].北京：高等教育出版社,1999：62-64

[11]趙量忠,王放銀.灰灰菜抗菌物質的提取及抗菌效果的研究[J].生物技術,2004,14(4)：66-67

[12]Andrews JM.For the BSAC working party on susceptibility testing, BSAC standar dized disc susceptibility testing method[J].Journal Antimicrobial Chemotherapy,2001,48(Suppl1)：43-57

[13]Clinial and Laboratory Standards Institute M100-S15.American standard book number[S].Wayne：Clinial and Laboratory Standards Institute Publishing House2005：100-115

[14]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].上海：上海科技出版社,1991：291

[15]李志洲,劉軍海,王俊宏,等.豬苓硒多糖連續合成工藝及抑菌性能研究[J].食品與機械,2013,29(1)：31-35

Study on Extraction and Activity of Effective Antibacterial Ingredients from Lonicera Japonica Leaves

LI Shi-chuan1，2，DU Hua-ying1，XIONG Jian-hua1，*，TANG Kai-jie1，WU Guo-ping1，WU Lei-yan1
（1.College of Food Science and Engineer，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，Jiangxi，China；2.The Twins Group Research and Development Center，Nanchang330096，Jiangxi，China）

To study the optimum extraction process and activity of antibacterial ingredients from Lonicera Japonica Leaves.The inhibition zone as evaluation index，and the normal reflux，ultrasonic extraction and Soxhlet extraction had been compared to obtain the relatively effective extraction method，meanwhile orthogonal experiment had been investigated based on the single factor experiment.In addition，gradient dilution method have been used for researching MIC and MBC.The results showed that，the reflux method was selected at last and the optimum condition of antibacterial ingredient sextraction was60%ethanol in 1.5 h at70℃and solid to liquid ratio 1∶15 g/mL.MIC was 250μg/g and 500μg/g for Staphylococcus aureus and Escherichia coli，respectively.MBC was 500μg/g and 1 000μg/g for Staphylococcus aureus and Escherichia coli，respectively. Conclusion，antibacterial ingredients from Lonicera Japonica Leaveswere extracted more fully by the normal reflux，the optimized technology is stable and viable．

Lonicera japonica leaves；effective antibacterial ingredients；extraction process；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.002

2013-12-02

國家自然科學基金地區基金項目（31060226）；江西省科技支撐項目（20122BBF60080）

李世傳（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：植物功能成分化學。

*通信作者：熊建華，女（漢），教授，碩士研究生導師，研究方向：食品安全及天然產物化學。