群體感應抑制劑控制微生物污染的研究進展

郭文慧，王錦利，周愛蓮，林其洋，魏奇，方婷

(福建農林大學食品科學學院，福建福州350002)

許多細菌之間存在交流。它們根據種群密度的改變來調整它們的基因表達。這種現象被稱為群體信號感應(quorum sensing，QS)。大量關于群體感應的工作在銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、費氏弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等致命性病原體中展開來闡明群體感應的機制。研究證明，群體感應過程包含信號分子的產生、信號分子在介質中的積累至某一闕值濃度、受體識別信號分子、根據信號－受體復合體的濃度進行大量基因的表達［1］。

群體感應主要存在3種系統。以自體誘導物-1(autoinducer-1，簡稱AI-1)為信號分子的群體感應系統。在這個系統中，一些革蘭氏陽性菌以小肽(autoinducer peptide)作為信號分子;革蘭氏陰性菌尤其是一些重要的病原菌通常以高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactonase，AHLs)分子作為信號分子，這些細菌中通常存在lu xI基因或lu xR基因［2］。以自體誘導物-2(autoinducer-2，簡稱 AI-2)為信號分子的群體感應系統在海洋生物發光細菌哈維氏弧菌中被發現，是最普遍的群體感應系統。該系統信號分子的前體物質為4，5-二羥基-2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，簡稱 DPD)。DPD是由S-腺苷高半胱氨酸經兩步酶促反應合成的［3］。相似地，在以自體誘導物-3(autoinducer-3，簡稱 AI-3)為群體感應的細菌細胞內也存在兩種激酶。但是，其信號分子還未被準確確定，其結構可能與兒茶酚胺類相似［4］。

近年來，相關研究證明群體感應抑制劑可以調節細菌的群體感應系統，控制細菌生物膜的形成、毒力的產生等代謝過程［5］，從而抑制細菌在物體表面的生長和繁殖，達到控制污染的目的。大量研究在篩選群體感應抑制劑和研究其作用機制中展開。為此，筆者簡單概括了自體誘導物確定的方法和理想群體感應抑制劑所需具備的條件，主要介紹了4種有群體感應抑制效用的植物精油，并且總結了多種有效的群體感應抑制劑。

1 自體誘導物的確定

通常使用根癌農桿菌NTL4(pZLR4)和紫色桿菌CV026確定以AHL為信號分子的群體感應系統。根癌農桿菌NTL4(pZLR4)自身不產生AHL分子。當存在外源AHL分子時，其β-半乳糖苷酶活性會被激活，使得培養基中的X-Gal被水解，從而產生藍色。但是，它對短鏈的AHL分子不敏感，所以使用紫色桿菌CV026作為報告菌，進行二次檢測。紫色桿菌CV026自身不能合成C6-HSL，可通過產生紫色色素報告存在外源的AHL分子，特別是側鏈長度為4～8個碳的 AHL 分子［6］。

通過哈維弧菌 MM32(ATCC BAA-1117，luxS，luxN)生物發光篩選以AI-2為信號分子的群體感應系統。這株菌株缺少luxS合酶、luxN蛋白酶和AHL受體，且自身不產生DPD信號。在存在外源誘導物的條件下，群體感應效應可以被測量［7］。

2 理想群體感應抑制劑需具備的條件

設計或尋找理想的群體感應抑制劑需考慮以下因素［8］:①群體感應抑制劑需是低分子質量化合物，這種化合物可以抑制群體感應相關基因的表達;②應對群體感應調節器有很高的特異性;③群體感應抑制劑需對真核宿主無毒;④群體感應抑制劑需不能干擾細菌細胞的基礎代謝過程如蛋白質的合成、DNA的代謝、細胞壁的形成，否則會使細菌產生耐藥性;⑤群體感應抑制劑的化學性質穩定，對宿主的代謝有一定的抵抗能力，可在宿主中存在充足的時間來發揮其效力。

3 群體感應抑制劑

群體感應抑制劑的強弱依賴于其產生效果的濃度。根據產生的作用和程度，觀察抑制劑的效用。

3．1 植物精油抑制劑

3．1．1 錫蘭肉桂(Cinnamomum verum)精油。研究表明，肉桂精油有抗群體感應能力，是長鏈和短鏈AHL群體感應系統的潛在抑制劑。錫蘭肉桂精油的氣相質譜－色譜聯用結果顯示，這種精油的主要成分為反肉桂醛(72．81%)、苯甲醛(12．5%)、丁香油酚(6．57%)。其中，丁香油酚是錫蘭肉桂精油中的主要成分之一。研究表明，當丁香油酚與抗生素一起使用于革蘭氏陰性菌中展示協同作用。在Polly Soo Xi Ya等［9］研究中，在接種量約為105CFU/ml的細菌培養液中，加入體積比為0．02% 的肉桂精油或體積比為0．02%肉桂精油混合濃度為256μg/ml哌拉西林。每4 h對100μl樣本進行可行性計數，持續24 h。通過對比肉桂精油組與肉桂精油和哌拉西林混合使用組，發現肉桂精油對大腸桿菌J53 R1有抗菌活性，并且與哌拉西林有協同效應。另一方面，用肉桂精油處理大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］，使得這兩株大腸桿菌的生物發光表達減少，表明存在群體感應抑制劑的可能性。當肉桂精油的濃度增加時，對大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］的抑制作用也被提升。因為大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］分別攜帶有las R和lux R受體基因，對大腸桿菌［pSB1075］和大腸桿菌［pSB401］產生抑制作用則表明存在抗群體感應活力。

通過使用陰離子洗滌劑SDS作為外膜滲透探針進行外膜滲透試驗，發現肉桂精油的主要作用模式為在致死或亞致死濃度破壞細菌膜系統，隨后增加抗生素進入細菌細胞的非特異性流動性［10－11］。這些結果表明肉桂精油不僅有透過細胞膜的能力，而且有抗群體感應作用。

3．1．2 牛至(Oregano)精油。牛至精油的抗菌活性在與食源性病源菌相關文章中被廣泛報道。Maria等［12］首先將3 g柑橘皮果膠、0．99 ml甘油、不同濃度的牛至精油(0、15．7、25．9 和36．1 mg/ml)溶解于 100 ml水中，并均質 15 min，接著倒入培養皿，在60℃下干燥24 h用于制備牛至精油果膠膜。在LB瓊脂板上布涂0．1 ml紫色桿菌(ATCC 12472)接種物;將果膠-牛至精油膜的紙片(0、15．7、25．9、36．1 mg/ml)和直接用牛至精油浸漬的紙片(0、6．25、12．5、25 mg/ml)置于LB板中;然后在30℃下培養24 h。培養后，記錄在紙片周圍的生長或產色抑制。結果顯示，6．25 mg/ml牛至精油、15．7 mg/ml牛至精油果膠紙片即可抑制紫色桿菌(ATCC 12472)產生紫色色素，且隨著濃度的提高產色被抑制的效果越明顯，當精油濃度超過一定濃度時還可抑制紫色桿菌(ATCC 12472)的生長。紫色桿菌(ATCC 12472)的紫色色素受群體感應系統控制。紫色色素的產生被抑制，表明牛至精油可抑制群體感應系統。

此外，通過量化紫色桿菌(ATCC 12472)色素產生的量，證明牛至精油有抗群體感應活力。其方法為先將紫色桿菌接種于包含不同濃度的牛至精油或果膠－牛至精油膜的LB肉湯中，并且在30℃下培養24 h;再從每個樣本中取1 ml培養物，離心，沉淀不溶性紫色桿菌素;將不溶性紫色桿菌素顆粒溶解于1 ml的二甲亞砜中，渦旋直到紫色色素被提取;接著，再次離心去除細胞;在585 nm處測量含紫色色素上清液的OD值，結果表示為紫色色素產物的百分含量。每個試驗的對照為不含牛至精油或果膠的LB培養基。對照樣本的色素產生設為100%。

Lambert等［13］報道了牛至精油對金黃色釀膿葡萄球菌的最小抑菌濃度為0．575 mg/ml。牛至精油的主要成分為香芹酚。Vattem等［14］曾報道了8 mmo/L的香芹酚可減少紫色桿菌的紫色桿菌素的產生，但不影響細菌的生存能力。試驗證明，牛至精油抑制色素產生的原因可能為香芹酚抑制了編碼高絲氨酸內酯基因表達。在以前的研究中曾報道了富含3%香芹酚的果膠膜使雞胸肉中的腸沙門氏菌和大腸桿菌157:H7(4．3～6．8 lg CFU/g)顯著減少。這些結果反映低濃度的牛至精油或添加牛至精油的果膠膜作為群體感應抑制劑的可能性。由于精油成分的復雜性，其具體作用機制還有待探尋。大部分研究人員將香芹酚素抑制色素的產生與減少編碼高絲氨酸內酯基因的表達聯系在一起。他們推測牛至精油作為群體感應抑制劑干擾的群體感應過程為:①信號分子生物合成或高絲氨酸內酯信號受體的抑制;②酶活性被鈍化或群體感應分子被生物降解。

3．1．3 阿魏(Ferula asafoetida L．)精油。在 Ehsan 等［14］報道了將25μg/ml阿魏精油加于紫色桿菌的培養物中可完全抑制紫色桿菌產生紫色色素的能力。此外，在銅綠假單胞菌中主要的3種QS系統分別為las、rhl和pqs系統。這3種系統影響銅綠假單胞菌的全基因組序列中6%基因的表達。這6%的基因中絕大多數與細菌特異性密度依賴的行為有關，如胞外多糖的合成、生物膜的形成、群集運動、抗生素的產生。銅綠假單胞菌的綠膿菌素是一個受QS系統控制的因素，主要由las系統調節。通過測量從穩定生長期銅綠假單胞菌中制備的樣本在520 nm處的光密度值，發現阿魏精油顯著地抑制綠膿菌素產物，表明阿魏精油抑制las系統。也有人提出質疑，認為綠膿菌素產物間接地受到培養基pH或鐵濃度的影響。經檢測，在整個試驗過程中，培養基pH無變化。同時，通過測量樣品中的鐵載體、彈性蛋白酶、結晶紫在405、495、650 nm處的光密度值，發現阿魏精油使得銅綠假單胞菌的鐵載體、彈性蛋白酶產物和生物膜的形成減少［15］。這也說明阿魏精油可作為新型群體感應抑制劑。

3．1．4 白草(Lippia alba)精油。Jesus 等［16］利用紫色桿菌CV026研究了白草中分離的5種精油對其生長的影響和潛在的抗群體感應活力。首先將精油溶解于二甲基亞砜中，然后加入無菌培養基中，使得最終濃度分別為0．01、0．1、10、100、200、300μg/ml，再采用肉湯稀釋法測定細胞生長抑制的情況，將等體積的紫色桿菌CV026置于不同濃度的精油和純二甲基亞砜(對照)中，然后置于30℃下培養18 h，在620 nm處測量其吸光度值。結果顯示，相對于溶劑對照組，5種白草精油都顯著地抑制了紫色桿菌的生長，并且其中的兩種精油的抑菌效果隨其濃度的增加更為顯著。

另一方面，通過向紫色桿菌CV026外源添加C6-HSL信號分子測試白草精油的抗群體感應能力。首先將過夜培養的紫色桿菌CV026的光密度值(OD620)調整至0．1;從中取出100μl細菌培養液加入到含有890μl的LB介質、5μl的C6-HSL(15 mmol/L)和 5 μl濃度分別為0．01、0．1、10、100、200和300μg/ml精油的無菌離心管中(對照組為加入5μl二甲基亞砜)。最后，包上鋁箔，在有氧的情況下培養24 h。研究結果顯示，來自白草的兩種精油是有效的群體感應抑制劑。其中一種包含最大檸檬醛——橙花醛，另一種包含最大檸檬烯和香芹酮，且這兩種精油對細胞生長的抑制作用很小。

采用紙片擴散法在金黃色葡萄球菌ATCC 25923中使用香葉醛/橙花醛型精油，發現10和5μl純精油可產生最大生長抑制區域。這些數據表明來自白草的精油對金黃色葡萄球菌有抗菌活性，且有望成為群體感應抑制劑［16］。但是，由于白草精油有一種或幾種主要的成分和許多種次要成分。因此，這些混合物對群體感應系統的具體作用模式是復雜的。盡管可以推測精油中的主要成分與次要成分之間有協同作用，還需要對其具體作用機制進行更加深入的研究。

3．2 呋喃型 呋喃型群體感應抑制劑活力和其抑制機制已被深入研究。據報導，已從海洋水藻D．pulchra中獲得鹵化呋喃酮。它們可保護水藻免受海洋細菌的黏附和淤積［17］。天然化合物(5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone也被稱為呋喃酮1。研究顯示，呋喃酮1在對浮游生物生長無影響的濃度下，可以抑制大腸桿菌聚集和生物膜形成。基于AHL和以自體誘導物2為信號分子的群體感應系統都可被呋喃酮抑制。由于呋喃酮這一類分子與這兩種群體感應的信號分子在結構上相似，原先人們認為呋喃酮的抑制機理為與自體誘導物競爭性結合其受體。近年來研究顯示，鹵化呋喃酮的抑制機理為破壞且促進費氏弧菌和哈維氏弧菌的luxR蛋白的轉變。這削弱了luxR與DNA的結合和發起轉錄的能力。研究證明，呋喃酮4可以提高銅綠假單胞菌生物膜對托普霉素的敏感性。溴化呋喃酮對革蘭氏陽性菌和真菌有效［18］。

3．3 群體感應淬滅酶 AHL-內酯酶、AHL-酰基轉移酶、對氧磷酶(paraoxonases，PONs)可降解群體感應信號分子。AHL-內酯酶可水解AHL的內酯環，且AHL-內酯酶已從多種細菌代謝產物中分離得到。通過大腸桿菌的功能性克隆確定了AHL-內酯酶由AiiA基因編碼。內酯酶是一種金屬蛋白，在活性部位有2個金屬鋅離子。在這種酶中，除鋅以外的殘基用于維持活性部位構象。AHL酰基轉移酶水解AHLs的酰胺結合鍵，從而降解AHL信號。產物為脂肪酸分子和高絲氨酸內酯。對氧磷酶類可水解AHL信號的高絲氨酸內酯環。對對氧磷酶進行結構研究和誘變研究，發現這3種酶PON1、PON2和PON3顯示了重疊的結構特征，但對底物的特異性不同［19］。

3．4 高絲氨酸內酯(homo serine lactone，HSL)類似物 這些分子是群體感應信號分子的類似物，可與信號分子競爭性地結合受體，阻礙群體感應。HSL類似物已被證實可抑制金黃色釀膿葡萄球菌形成生物膜。使用3種群體感應報告菌株根癌農桿菌(含TraR質粒)、銅綠假單胞菌(含LasR質粒)、費氏弧菌(含LuxR質粒)進行AHL數據庫篩選。使用基于gfp報告基因構建報告菌株，可構建HSL類似物數據庫，同時進行AHL抑制劑的篩選。群體感應抑制劑分子可使gfp報告基因的表達減少50%或更多。使用自體誘導物的局限性在于以下兩點:①大多數HSL類似物可與HSL分子競爭性結合受體位點所需的濃度;②可能存在副作用。由于HSLs通常作為免疫抑制劑，HSLs的類似物可能使病人的免疫力降低［20］。

3．5 AI-2的類似物 這些類似物可與QS信號競爭且阻塞內生性QS信號與其受體的結合。AI-2的C-1烷基類似物被報道競爭性與lsrR調節器結合而作為群體感應抑制劑。盡管這些群體感應抑制劑可廣泛用于多種細菌，它們仍對一些目標細菌顯示出很高的選擇性。一些烷基類似物對大腸桿菌有特異性，其中只有丁基-和異丁基-DPD抑制鼠傷寒沙門氏菌的信號分子，盡管來自這兩種細菌的lsrR蛋白享有高度的同源性和相似的折疊結構［21］，硼酸和DPD類似物已被用作AI-2的拮抗劑。

3．6 肽和抗體 從金黃色葡萄球菌IV型中合成的小肽以劑量依賴方式抑制金黃色葡萄球菌I型agr基因的表達。相似的，人們設計了一種小肽分子。這種小肽分子對4種類型的金黃色葡萄球菌都可產生作用，以此作為金黃色葡萄球菌的廣譜群體感應抑制劑。抑制RNAIII的肽對耐藥性葡萄球菌中以agr介導的生物膜形成有抑制作用［22］。群體感應信號的抗體對群體感應過程有阻礙作用。通過接種含AI-1信號分子的疫苗，并由此產生抗體。這種抗體可干擾群體感應，并在小鼠對抗銅綠假單胞菌感染肺部的過程中保護小鼠。

4 展望

近年來大量研究工作在篩選群體感應抑制劑和探索群體感應抑制劑機制中展開，目的是為尋找有效的群體感應抑制劑。現已發現多種來自植物的精油有群體感應抑制效果。來自植物的精油成分天然，更加安全，更易獲取，展示在食品行業中控制微生物污染的前景。隨著群體感應抑制劑的作用機制被更加深入地研究，在不遠的將來更多天然、無毒、有效的群體感應抑制劑將被開發和投入生產，使其成為控制人類、動物和植物病原菌污染的有效選擇，并且造福農業、漁業、造紙業等易受微生物污染的行業，發揮其不可替代的作用。

［1］ADONIZIOA L，DOWNUM K，BENNETT B C，et al．Anti-quorum sensing activity of medicinal plants in southern Florida［J］．J Ethnopharma，2006，105:427-435．

［2］MILLER M B，BASSLER B L．Quorum sensing in bacteria［J］．Ann Rev Microbiol，2001，55:165-199．

［3］WATERSCM，BASSLER B L．Quorumsensing:Cell to cell communication in bacteria［J］．Anal Rev Cell Dev Biol，2005，21:319-346．

［4］ASAD S，OPAL S M．Bench-to-bedside review:Quorum sensing and the role of cell-to-cell communication during invasive bacterialinfection［J］．Crit Care，2008，12:236．

［5］SCHONEWILLE E，NESSEL L，HAUCK R，et al．Biofilm building capacity of Salmonella enterica strains fromthe poultry farmenvironment［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2012，65:360-365．

［6］PéREZ-MONTA N～O F，JIMéNEZ-GUERRERO I，SáNCHEZ-MATA MOROSR C，et al．Rice and bean AHL-mimic quorum-sensing signals specifically interferewith thecapacity toformbiofilmsby plant-associated bacteria［J］．Research in microbiology，2013，164(7):749-760．

［7］TSUCHIKAMA K，ZHU J，LOWERY C A，et al．C4-alkoxy-HPD:A potent class of synthetic modulators surpassing nature in AI-2 quorum sensing［J］．J Am Chem Soc，2012，134:135:62-64．

［8］RASMUSSEN T B，GIVSKOV M．Quorum sensing inhibitors:a bargain of effects［J］．Microbiology，2006，152:895-904．

［9］YAPPS，KRISHNAN T，CHANK G，et al．Antibacterial mode of action of Cinnamomum verum bark essential oil，alone and in combination with piperacillin，against a multi-drug-resistant Escherichia coli Strain［J］．JMicrobiol Biotechnol，2015，25(8):1299-1306．

［10］EUMKEB G，SIRIWONGS，PHITAKTIM S，et al．Synergistic activity and mode of action of flavonoids isolated fromsmaller galangal and amoxicillin combinations against amoxicillin-resistant Escherichia coli［J］．JAppl Microbiol，2012，112:55-64．

［11］EUMKEB G，SIRIWONGS，THUMANUK．Synergistic activity of luteolin and amoxicillin combination against amoxicillin-resistant Escherichia coli and mode of action［J］．J Photochem Photobiol B Biol，2012，117:247-253．

［12］ALVAREZ1 M V，ORTEGA-RAMIREZL A，MELISSA GUTIERREZ-PACHECO M，et al．Oregano essential oil-pectin edible films as anti-quorum sensing and food antimicrobial agents［J］．Frontiers in microbiology，2014，5:699．

［13］LAMBERT R JW，SKANDAMISPN，COOTE PJ，et al．A study of them inimuminhibitory concentration an dmode of action of oregano essential oil，thymol and carvacrol［J］．J Appl Microbiol，2001，91:453-462．

［14］VATTEM D，MIHALIK K，CRIXELL，S et al．Dietary phytochemicals as quorum sensing inhibitors［J］．Fitoterapia，2007，78，302-310．

［15］SEPAHI E，TARIGHIS，AHMADI FS，et al．Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa by two herbal essential oils from Apiaceae family［J］．Journal of microbiology，2015，53(2):176-180．

［16］OLIVERO-VERBEL J，BARRETO-MAYA A，BERTEL-SEVILLA A，et al．Composition，anti-quorum sensing and antimicrobial activity of essential oils from Lippia alba［J］．Brazilian Journal of Microbiology，2014，45(3):759-767．

［17］GIVSKOV M，DE NYSR，MANEFIELD M，et al．Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signaling［J］．J Bacteriol，1996，178:6618-6622．

［18］BHARDWAJ A K，VINOTHKUMAR K，RAJPARA N．Bacterial quorum sensing inhibitors:Attractive alternatives for controlof infectious pathogens showing［J］．Multiple drugresistance recent patents on anti-infectivedrug discovery，2013，8:68-83．

［19］KIM MH，CHOIWC，KANGH O，et al．The molecular structure and catalytic mechanism of a quorum-quenching N-acyl-L-homoserine lactone hydrolase［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:17606-17611．

［20］CHARLTONK A，PORTERA JR．Methods for the treatment of an infectious bacterial disease with an anti-lactone or lactone derived signal molecules antibody:EP，1528935［P］．2012．

［21］ROY V，SMITH JA，WANG J，et al．Synthetic analogs tailor native AI-2 signaling across bacterial species［J］．JAm Chem Soc，2010，132:11141-11150．

［22］MCDOWELL P，AFFASZ，REYNOLDSC，et al．Structure，activity and evolution of the group I thiolactone peptide quorum-sensing system of Staphylococcus aureus［J］．Mol Microbiol，2001，41:503-512．