稻米直鏈淀粉檢測技術的研究現狀與展望

劉 姍 王建軍 范小娟 王林友 張禮霞（浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 3004）

（浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所2，杭州 310021）（浙江農林大學農業與食品科學學院3，臨安 311300）

稻米直鏈淀粉檢測技術的研究現狀與展望

劉 姍1，2王建軍1，2范小娟2，3王林友2張禮霞2（浙江師范大學化學與生命科學學院1，金華 321004）

（浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所2，杭州 310021）（浙江農林大學農業與食品科學學院3，臨安 311300）

直鏈淀粉含量是影響稻米蒸煮品質和食味品質的重要指標之一。隨著人們對稻米品質追求的日益提高，研究與開發快速、準確、有效的直鏈淀粉含量檢測技術，對于優質稻米的培育與生產，或稻米質量的鑒定與控制都是不可或缺的。綜述了稻米直鏈淀粉含量檢測技術的演變與發展，根據直鏈淀粉與支鏈淀粉的物理或（和）化學特性，目前已開發的直鏈淀粉含量檢測技術可以歸為4大類14種方法，敘述了各種方法的原理與應用現狀，比較了各方法之間的優缺點，展望了直鏈淀粉含量檢測技術的應用前景。

稻米 直鏈淀粉 檢測技術

稻米是世界谷物中最重要的糧食之一，全球有一半以上人口賴以為生。作為世界上最大的稻米生產國，大米一直是我國傳統的主糧。中國有近10億人口把大米及其制品作為主食，我國年均消費量在1.6億t左右［1］。近年來，隨著人們生活水平的提高和市場發展的多樣化，對稻米的要求從單一的追求產量，向優質食用、加工專用、風味特用和耐貯備用等多樣化目標發展，因此，對稻米品質的檢測技術及評價體系提出了更高的要求。

已有的研究表明，稻米的食味品質與稻米本身的理化性狀密切相關，直鏈淀粉含量（amylose content，AC）、膠稠度、糊化溫度、蛋白質含量、水分、脂肪等相互作用影響稻米食味品質，其中直鏈淀粉含量是最主要的理化指標［2］。稻米淀粉中主要由直鏈淀粉（amylose，Am）和支鏈淀粉（amylopectin，Ap）組成，兩者之和約占稻米成分的90%。稻米中直鏈淀粉含量變化在0%～40%，直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例以及支鏈淀粉的精細結構決定了水稻籽粒的理化性質、營養品質。AC值直接影響稻米在蒸煮過程中水分的吸收、體積的擴張及飯粒的散裂性等，是決定食味品質和加工特性最重要的性狀之一，可作為評價稻米食用品質的一個重要指標。因此，快速、簡便、準確地測定AC值，對稻米加工、淀粉工業利用、稻谷貯藏、品種選種都具有十分重要的意義。

自1970年首次提出碘比色法測定稻米AC值以來，稻米AC測定技術有了突飛猛進的發展。從單波長比色法，經過改進提出了雙波長比色法和多波長比色法，進一步發展出基于碘比色法的一系列新測定技術，如碘親和力測定法、伴刀豆球蛋白法、自動分析檢測儀。一些學者利用稻米理化特性，引進了新的檢測儀器，開發出近紅外光譜分析法、高光譜法、RVA快速黏度分析法等檢測手段；及基于分子基團特性開發出色譜分析法、差示掃描量熱法、非對稱流場流分離技術等。本綜述就稻米AC測定技術的研究現狀、存在問題以及今后的發展方向進行了闡述與展望。

1 碘比色法

碘比色法是測定稻米AC值的經典且最常用的方法。Williams等［3］最先提出利用碘比色法測定稻米AC，其后Juliano等［4］對該方法進行了改進。

1.1 單波長比色法

1.1.1 標準法

單波長比色法是國際上認可的測定AC值的標準方法。目前，我國推薦試驗的測定稻米AC值的標準方法有3種，即國際標準ISO 6647－2—2007《稻米直鏈淀粉含量測定第2部分常規方法》［5］、國家標準GB／T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》［6］及農業部標準NY／T 83—1988《米質測定方法》［7］。這3種標準方法的區別主要表現在樣品及標樣是否進行脫脂處理、脫脂后靜置時間。其中國標法要求脫脂并靜置2 d，耗時最長。吳秋婷等［8］發現脫脂處理的AC值顯著高于未脫脂處理的測定值，不脫脂和脫脂處理之間AC測定值可用“0.89”比值進行轉換。標準方法的主要技術局限性是前處理較麻煩、操作步驟較繁鎖、技術性要求較高。

1.1.2 簡易測定法

簡易測定法是在標準方法的基礎上，經技術簡化與改進而建立起來，其基本原理與標準方法相同，如對農業部標準（NY 147－1988）進行簡化，以10mg樣品代替了標準中的50mg樣品，其所用的試劑也相應按比例減少。梅淑芳等［9］報道了農業部部標簡易測定法，以梯度化AC的稻米樣品進行簡化測定方法的可靠性驗證，并與部標標準測定值相比較，結果簡易法測定值與標準法測定值成高度正相關（r＝0.999 6），2種方法測定值之間的絕對誤差小于1.2%。與標準法相比較，簡易法具有簡單易操作、樣品量少等優點。

1.2 雙波長比色法

雙波長比色法與單波長比色法相比，不同點在于分光光度計測定時選用了2個波長測定吸收值，因而可以同時測出直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。其原理是利用溶液中某溶質對2個波長的吸光度差值與溶質濃度成正比，測定吸光度差值，可消減兩類淀粉吸收背景的相互影響，因此提高了測定的靈敏度和選擇性。雙波長法測定前需要繪制Am和Ap的標準曲線。

Zhu等［10］比較了雙波長比色法與單波長比色法、差式掃描量熱法、排阻色譜法測定2類淀粉含量的準確性，結果認為雙波長比色法比較準確、且有應用價值。戴雙等［11］用單波長法和雙波長法測定小麥的AC，結果雙波長法優于單波長法。范明順等［12］以高粱為樣品用雙波長法測定2類淀粉含量，結果顯示雙波長法的重現性較好，相對標準偏差小于1%。雙波長比色法可以有效地克服因長鏈Ap與碘形成的絡合物其吸收光譜波長接近于Am－碘絡合物的吸收波長，從而導致所測定的AC比真實值偏高的缺點，測定結果更為準確。雙波長法可以同時獲得總淀粉、Am和Ap含量3個指標，工作效率高，缺點是需同時制備2類淀粉的標準曲線。

1.3 多波長比色法

多波長比色法在比色時需測定3個或以上波長的吸收值。Wang等［13］報道可同時測定Am、Ap和總淀粉含量的三波長比色法，這一方法結果更精確，然而由于所用的波長數目多，結果計算公式非常復雜［14］。戴雙等［11］對單波長法、雙波長法和多波長法的比較表明，多波長法測定復雜、計算繁瑣，認為雙波長法更適于同時測定Am和Ap含量。

2 基于碘比色法衍生的檢測方法

不僅僅是標準方法，常用的AC測定方法都是利用直鏈淀粉與碘形成絡合物的呈色反應。隨著科學技術的發展，在碘比色法的基礎上，結合運用其他物理學或化學技術，創新而衍生出幾種新的方法。

2.1 碘親和力滴定法

碘親和力滴定法是在測定過程中用電物理學滴定代替了光比色技術。該方法包括安培滴定法［15］和電位滴定法［16］，其原理是在碘與淀粉形成絡合物期間電化學性質，如電位／電流可發生變化，測定這種變化，對照先前繪制的標準曲線，推算出與碘結合的淀粉量。

陳俊芳等［17］以稻米為材料，比較碘比色法和電位滴定法測定Am和Ap，結果電位滴定法直線回歸方程的相關系數更加接近l，測定結果的穩定性、重復性更好。由此可見，電位滴定法具有簡便、快速、準確的優點，采用多函數擬合繪制的工作曲線，獲得的數據更精確、重復性更高。

2.2 橫切浸染法

Agasimani等［18］報道了一種簡單快速的單籽粒AC測定的新方法——橫切侵染法。對低AC（10%～20%）、中AC（20%～25%）和高AC（＞25%）的3類樣品，用刀片橫切成熟的籽粒中部，在橫切面上滴一定濃度的KI－I，淀粉與碘液發生染色反應，染色從中間向四周呈放射狀擴散。這一擴散過程所需的時間因樣品而不同，通過測定已知AC標準樣品的碘浸染擴散所需時間，建立擴散時間與AC的計算表，可以估測出待測樣的AC值。Agasimani等［18］以800個M2誘變分離群體做橫切浸染試驗，結果736個有相對穩定擴散時間，利用計算表估計出AC值；其余64個擴散時間不穩定性。進一步在4組中分別選取20個突變體，用CGD法估測其AC值，并以碘比色法為對照，結果表明2種方法的判定系數R2大于0.9，具有很好的相關性。CDG法簡單快速、操作方便，不需昂貴的儀器，且另一半帶胚部分還可以正常發芽，以備其他研究使用。

Avaro等［19］報道了用碘染色判斷稻米AC的簡易測定方法，其前面的步驟與標準法相近，不同的是省去了分光光度計比色這一步，而是用自制的比色卡來粗略判斷AC值。王躍星等［20］報道了另一種與此方法原理相同的推測AC值范圍研究，其采用磨粉糊化后進行簡易碘藍染色，根據染色程度推測稻米的AC值。文獻［21－24］分別在馬鈴薯、豌豆、高粱、大麥的AC檢測方面開發了基于碘比色法的簡易測定法。

2.3 伴刀豆球蛋白法

伴刀豆球蛋白法（Concanavalin A Method，Con A Method）主要是利用支鏈淀粉可與Con A生成絡合物，而直鏈淀粉不能與Con A生成絡合物這一特性開發出來的一種新AC測定法。經脫脂處理的稻米粉溶液在特定的溫度、pH值和離子強度下加入一定量的Con A，Con A與支鏈淀粉形成絡合物，離心除去沉淀的絡合物，加入α－淀粉酶／葡萄糖淀粉酶水解上清液中的直鏈淀粉形成葡萄糖；同時將另一份獨立的脫脂米粉溶液樣本，直接加α－淀粉酶／葡萄糖淀粉酶水解成葡萄糖。最后用碘比色法測定2份樣品中葡萄糖的含量，計算出直鏈淀粉含量和總淀粉含量，差值為支鏈淀粉含量。該法最早由Yun等［25］和Matheson等［26］提出，后經Gibson等［27］對試驗操作過程進行了改進。Gibson等［27］驗證Con A法與碘比色法所測定值的相關系數達0.933，結果的相對標準差（RSD）小于5%，米粉樣品則小于10%。

Con A法的優點是不需要校準曲線，準確性高，無需昂貴的儀器，無需預純化過程，可以測定脫脂處理的米粉或純淀粉樣品。目前，市場上有商品化的試劑盒出售，如MEGAZYME直鏈淀粉試劑盒［28］。

2.4 自動分析檢測法

自動分析檢測法是基于碘比色法運用自動控制技術、信息技術、人工智能技術等研發的儀器分析檢測代替了的人工操作與計算。自動分析檢測儀是農作物品質鑒定的專用儀器。國外研究起步較早，已陸續推出有商業價值的一系列自動分析檢測儀，如法國Alliance公司研制的FUTURA II全自動連續流動分析儀、荷蘭SKALAR儀器公司的SKALAR SAN＋＋化學自動分析儀、瑞典Foss公司的FIAstar 5000型直鏈淀粉自動分析儀。這些儀器性能可靠、智能化程度高，但其價格相對比較昂貴。在國內，研制測定自動分析檢測儀的工作相對較晚，張巧杰等［29］設計一種類似的儀器，并驗證了其穩定性［30］，目前，已有中國農業大學研制的DPCZ－2型直鏈淀粉測定儀在商業化銷售，其很好地結合了計算機技術和分光光度技術，可以用于小麥、玉米、大米等多種谷物的AC快速測定。劉衛國等［31］、倪小英等［32］分別比較了自動分析儀與國標法測的AC值結果，2種方法所得結果的相對標準偏差1.9%，表明自動分析檢測法具有很好的可靠性和可重復性。目前這一技術主要在專業的檢測機構使用。

3 基于理化特性的新檢測方法

3.1 近紅外光譜分析法

近紅外光譜分析法（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）是近年興起的一種定量分析技術，其最大的優點是無損檢測。劉建學等［33］用近紅外光譜對不同粒度、不同類型的大米進行檢測，建立了稻米AC的檢測模型，結果表明對精米樣品檢測值與化學分析值的相關系數高達0.95。陳峰等［34］，利用NIRS法和化學法測定54個水稻表觀AC，2種方法的決定系數R2＝0.68。彭建等［35］也得到了類似的結果。

NIRS技術對禾谷類種子的無損檢測具有開創性的意義，對農作物品質育種研究尤其重要，但NIRS測定之前需要建模，所建模的優劣直接決定了的測定結果的準確性，而且各機器間所建的模塊不能相互通用，因此，需要耗費較大的人力和物力。

3.2 高光譜分析法

利用高光譜遙感技術測定或監測作物生化組分或品質是一項新近發展起來并在熟化中的新技術。利用作物的生化組分在0.4～2.4μm光譜內的光譜吸收有微弱差異，這些明顯的特征可以直接進行生化組分的定量分析。劉蕓等［36］用高光譜儀掃描秈稻、粳稻和雜交稻的米粉樣品的反射光譜，經計算證實了原始光譜反射率和一階導數光譜與米粉的粗蛋白質、粗淀粉和AC存在相關性，以相關系數較大的光譜變量建立AC的估算數學模型，其檢驗精度在82.5%～94.9%。薛利紅等［37］測定不同生育期水稻冠層高光譜反射率與總淀粉和AC的相關性，結果它們之間存在顯著或極顯著的相關性，總淀粉含量在灌漿盛期的近紅外波段達到了顯著水平（r＞0.74）。謝曉金等［38］進一步測定并建立了粗蛋白含量和AC的監測模型，運用獨立數據檢驗模型準確度為0.708～0.923。小西教夫等［39］也報道了遙感技術測定水稻蛋白質含量和淀粉含量的研究。

高光譜遙感技術在農作物的品質監測中具有明顯的技術優勢，它可以用來快速、低成本地檢測稻米品質，發展與利用前景十分喜人。

3.3 快速黏度分析法

早期開發出Brabender黏滯淀粉譜儀可測定米粉黏滯淀粉譜，后經改良推出快速黏度分析儀（rapid viscosity analyzer，RVA），并于20世紀末引入稻米品質測定［40］。RVA可測定米糊的峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、消減值、回復值、峰值時間、起漿溫度等特征值，這些特征值與稻米的外觀品質、蒸煮品質和營養品質存在內在關聯，因此，可以預測或判定稻米品質的優劣。

李剛等［43］測定了106份水稻的RVA譜的特征值與外觀品質、蒸煮品質的相關性，結果崩解值和消減值與堊白米率的相關系數為－0.43和0.40，低AC品種及糯性品種的AC值與RVA譜特征值相關，其中糯性品種的相關系數達0.87～0.99。隋炯明等［42］分析了215水稻RVA譜特征值與品質的相關性，發現表觀直鏈淀粉含量（ACC）與8項RVA譜特征值均呈現顯著或極顯著相關。胡培松等［41］利用此技術對稻米樣品進行了測定，分析結果發現AC、GC與RVA譜的6個特征值相關最明顯，相關系數在0.9以上。這些結果表明，利用RVA特征值與AC或AAC的存在關聯性，利用線性回歸定量分析模型可開發出AC預測模型。

利用RVA儀預測AC的方法有很大的技術優勢，其樣品用量少、測定時間短、可重復性高，而且可以預測堊白率、膠稠度、糊化溫度等蒸煮品質，最終給出樣品的食味評價。因此，應用的前景十分誘人，非常適合品種選育及大批量樣品的快速測定。

4 基于分子基團特性的新檢測方法

4.1 體積排阻色譜法

體積排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）又叫凝膠滲透色譜法。其原理是利用Am的最小相對分子質量，一般在幾萬到幾百萬之間，Ap的相對分子質量最大，約在幾百萬到幾億之間，中間級分是介于Am和Ap之間的多糖成分。當淀粉在進入凝膠色譜后，會依據分子質量的不同，進入或不進入固定相凝膠的孔隙中，支鏈淀粉分子質量大不能進入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫，而能夠進入凝膠孔隙的直鏈淀粉則需要更長時間的沖洗才能夠流出固定相，從而實現對Am和Ap的分離。將淀粉樣品通過體積排阻色譜柱，得到3個峰，分別代表Am、中間級分和Ap，根據色譜圖面積推算出各種淀粉的含量。

蔡一霞等［44］用Sephadex G75層析柱分析了稻米中支鏈淀粉分枝鏈的鏈長分配，經分離獲得的FrⅠ部分的鏈長的平均聚合度＞100 GU（glucose unite），FrⅡ部分的鏈長的平均聚合度為44～47 GU，FrⅢ部分的鏈長的平均聚合度為10～17 GU。Zhong等［45］采用二甲亞砜等復配溶劑溶解稻米淀粉，經體SEC－多角度激光光散射法，分析稻米總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉的均重分子質量（Mw），結果直鏈淀粉的Mw約3×106，支鏈淀粉為4×107～5×107。楊小雨等［46］建立了稻米支鏈淀粉鏈長相對分子質量布的HPSEC分析方法，并測定了稻米支鏈淀粉的相對分子質量分布，結果表明該方法數據可靠、重復性好、簡單易行。體積排阻色譜法具有操作簡單，速度快，效率高，準確度高，無污染，對中間級組分的定性定量研究也有一定的意義。

4.2 流場流分級法

場流分離技術（field flow fractionation，FFF）是一項可分離、提純和收集流體中的懸浮物微粒的系列技術［47］。液相中的場流分級即流場流分級（flow field－flow fractionation，FlFFF）是將流體和外場協調作用，利用樣品的質量、體積、擴散系數、電荷等物理特性上的差異實現分離，用分離物質的特異性質確定樣品顆粒粒徑及分布、分子質量。FlFFF技術與SEC技術原理相似。相比較而言，FlFFF技術對分離超高分子質量聚合物更具優點：1）能最大限度地減少大分子的降解或吸附；2）與SEC相比，FlFFF適用的分子質量范圍更廣；3）可以相對容易地調整流量、磁場強度等控制分離范圍、分辨率和分析時間。

Kim等［48］報道FlFFF可以分離淀粉水溶液中的Am和Ap，且雙程序FlFFF可更好地分離玉米淀粉中的Am和Ap。通過優化FlFFF技術可開發為分析淀粉和相似材料的新方法。如果需要準確測定Am和Ap的分子質量和流體動力學特性，可以將FlFFF與MALS技術在線耦合使用。

4.3 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定AC的原理是：溶血磷脂酰膽堿的極性端基團與淀粉的螺旋形結構相互作用產生絡合物，并且該絡合物所形成的放熱曲線與淀粉中AC成比例關系。目前使用的DSC設備都配置有自動取樣裝置，可進行自動分析，方法操作簡單，應用便利。

Mestres等［49］報道了DSC法測定淀粉樣品AC值，通過比較樣品的焓與標樣純直鏈淀粉的焓（ΔH≈25 J／g），計算出樣品的AC值，并認為該測定值較為準確可靠。Polaske等［50］對5種AC的玉米淀粉樣品，分別采用DSC法和碘比色法測定AC值，結果表明2種方法測定值的相關系數達0.99，相關性很好。

表1 稻米直鏈淀粉測定方法比較

5 總結

隨著人們對稻米品質的日益重視，國內與國際上都在不斷地研發稻米蒸煮品質和食味品質的測定方法，不斷地推出新穎、實用、簡便的檢測技術。其中，AC測定方法或技術的發展最引人注目，至今已開發的AC檢測技術有14種之多，根據各方法的原理，可以大致歸為4大類。表1歸納了這14中方法的基本情況，敘述了各種方法的原理與應用現狀，比較了各方法之間的優缺點。

6 展望

縱觀稻米AC測定方法與技術的發展史，可以發現有幾個發展的節點與特點值得關注。如從單波長法發展到雙波長比色法甚至多波長法，使測量準確性獲得了顯著地提高，但同時其操作程序也愈加復雜。橫切浸染法不失為一種單粒稻米AC估測的快捷有效途徑，且保留帶胚的一半可以正常生長以備其他研究之用。近紅外光譜分析法對稻米的無損檢測是具有開創性意義，商業化應用也較為成熟。高光譜法作為一種快速、低成本檢測稻米品質方法的可行性已得到試驗驗證，未來其在農作物的品質檢測中將表現出強大的優勢。RVA法在AC測定應用中的可行性已被證實，但其精確定量的應用還有待研究。體積排阻色譜法和流場流分級技術使得直鏈淀粉和支鏈淀粉的同步定量變得很簡單，對淀粉中間級多糖定性定量分析也有一定的參考價值。可以預見，隨著物理學、分析化學、信息技術、生化技術的日新月異地發展，AC檢測的方法與技術也會得到不斷地完善與改進，并將在稻米品質的分析與評價中發揮重要的作用。

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Status and Prospects for Determination for Amylose Content in Rice

Liu Shan1，2Wang Jianjun1，2FanXiaojuan2，3Wang Linyou2Zhang Lixia2（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University1，Jinhua 321004）
（Institute of Crops and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences2，Hangzhou 310021）（School of Agricultural and Food Science，Zhejiang A＆F University3，Linan 311300）

Amylose content（AC）is one of important factors affecting the cooking quality and eating quality in rice.With the increasing demand of rice quality，to research and develope a fast，accurate and efficient determination of rice AC is essential for breeding and production of high－quality rice as well as identification and control of rice quality.In present paper，the evolution and development of determination methods of rice AC have been reviewed extensively.According to the physical and chemical characteristics of amylose and amylopectin，different methodswere grouped into fourmajor categories and fourteenmethods of determination.Each principles and applications of determinationmethodswere described；the advantages and disadvantages have been also discussed.Ultimately，it has prospected the future and applications of these AC determination methods in research of rice quality.

rice，amylose content，determination methods

TS232

A

1003－0174（2015）

浙江省重大專項（8812計劃）（2012C12901－12），國家科技計劃（2011BAD35B02－03）

2013－10－10

劉姍，女，1989年出生，碩士，糧油品質分析與測定

王建軍，男，1965年出生，研究員，稻米品質控制與改良03－0140－07