載脂蛋白E基因與腦血管淀粉樣變對高血壓腦出血的影響

羅仁國 印曉鴻 范 杰 段 劼 楊彬彬 唐曉平

川北醫學院附屬醫院神經外科 南充 637000

高血壓腦出血（hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH）是一種常見的腦血管病，具有高病死率和致殘率等特點，其發生與腦動脈粥樣硬化、腦淀粉樣變血管病、血液病、動脈瘤等有關。大腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）是由于淀粉樣蛋白（其中最常見的是β淀粉樣蛋白）在大腦血管壁沉積并不斷替代平滑肌層，導致血管壁損害破裂出血及其他血管病變，進而導致腦出血。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是體內一種十分重要的載脂蛋白，可在血漿膽固醇和甘油三酯的代謝過程中發揮作用，還通過影響β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）在血管壁在沉積，發生CAA。本研究通過對高血壓腦出血患者及正常人進行ApoE的多態性分析，并檢測Aβ的表達，探討ApoE及Aβ在高血壓腦出血發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2013-06—2014-06我院住院治療的HICH患者300例，男165例，女135例，平均年齡（48.65±6.74）歲；所有患者均具有詳細且完整的病史，排除腎功能不全、腎病綜合征、甲狀腺疾病、肝硬化以及腫瘤等可能影響血脂蛋白代謝的疾病。對照組為我院體檢中心體檢的正常成人150例，男82例，女68例，平均年齡（47.78±7.24）歲。

1.2 方法 所有研究對象均隔夜禁食＞12h，次日清晨空腹抽靜脈血后并加EDTA抗凝，常規提取DNA、RNA進行ApoE基因多態性檢測以及β淀粉樣蛋白的半定量檢測。取經手術治療的高血壓腦出血患者血腫周圍毀損腦組織標本，進行H-E染色及剛果紅染色并觀察。

1.2.1 ApoE基因檢測：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法（PCR-RFLP）檢測2組ApoE基因。首先，提取基因組DNA，采用PCR法擴增取ApoE基因片段，按照文獻［1］對ApoE基因進行分型，分析ApoE的多態性選取ApoE基因包含編碼第112位和158位氨基酸的一段基因序列，擴增引物：F4：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’；F6：5’TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’；擴增產物為244bp，將擴增產物加入限制性內切酶HhaI過夜處理后，產物再用非變性丙烯酰胺凝膠電泳分離、染色顯色后觀察并拍照。

1.2.2 β淀粉樣蛋白前體的半定量檢測：β淀粉樣蛋白主要由淀粉樣B蛋白前體（Aβ16-17）水解產生，參照文獻［2］，以人類紅細胞β血影蛋白基因為參照模板，為gApp，樣本RNA經反轉錄成cDNA，擴增后稱為cApp，對cApp及gApp競爭RT-PCR，計算出gApp及cApp的DNA條帶光密度值，求得兩光密度值的比值log值，以競爭RT-PCR不同濃度值為X軸，兩光密度值得log值為Y軸，作直線回歸分析，計算出相對cApp的相對半定量值。

1.2.3 β淀粉樣蛋白染色：H-E染色，先固定切片，二甲苯脫水透明，石蠟包埋，乙醇脫蠟染色，蘇木精水溶液染色；鹽酸酒精與氨水分色；酒精伊紅染色液染色；脫水透明；封片后觀察。剛果紅染色，石蠟包埋，切片脫蠟染色，甲醇剛果紅染液染色，堿性乙醇分化液分化至不再褪色，蘇木素淡復染細胞核，脫水，透明封片后觀察。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，ApoE基因型分布及等位基因頻率通過Hardy-Weingerg平衡定律進行群起平衡驗證，計量資料采用±s表示，計量資料數據比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦出血組標本觀察 CAA主要累及大腦皮質和軟腦膜中小動脈及毛細血管。顯微鏡下可見中小動脈壁及毛細血管壁的中層和外膜有淀粉樣物沉積，尤其在鄰近外膜的外表面，嚴重時血管壁中層彈力層消失，進而完全被淀粉物取代。淀粉樣沉積物在H-E染色時呈非結晶嗜伊紅物質，而用剛果紅染色后顯微鏡下淀粉樣物質呈桔紅色改變，偏振光顯微鏡下呈黃綠色雙折射光。

2.2 ApoE基因型頻率及等位基因頻率分布 研究發現，腦出血組基因型頻率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，分別為23.67%、26.33%，而ε4／ε4與ε2／ε4基因型次之，ε2／ε2與ε2／ε3基因型最少。正常對照組ε3／ε3基因型最多，ε4／ε4最少，統計發現腦出血組ε3／ε3、ε4／ε4、ε2／ε4及ε3／ε4基因型與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。研究等位基因頻率發現，腦出血組ApoEε2基因較正常對照組增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），腦出血組ApoEε3基因（75.33%）較對照組減少（41.83%），差異有統計學意義（P＜0.01），腦出血組ApoEε4基因較正常對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1 2組ApoE基因型頻率 （%）

表2 2組ApoE等位基因頻率 （%）

2.3 2組不同apoE等位基因間Aβ表達 研究發現，ApoE基因的不同等位基因對腦出血組Aβ的表達均較對照組增加，其中ε4基因對腦出血組Aβ表達影響最大，為（3.43±0.70）pmol／g，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。ApoEε3基因對腦出血組Aβ的表達次之，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），ApoEε3基因對腦出血組的Aβ表達最少，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。統計發現，ApoE等位基因間Aβ表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 ApoE等位基因與Aβ16-17水平比較 （±s，pmol／g）

表3 ApoE等位基因與Aβ16-17水平比較 （±s，pmol／g）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；ApoE等位基因間比較，P＞0.05

組別 n ε2 ε3 ε 4腦出血組300 3.24±0.52＊3.28 ±0.62 ＊3.32 ±0.61 ＊對照組150 2.42±0.43 3.44±0.54 3.02±0.45

3 討論

血管淀粉樣變高血壓腦出血，顯微鏡下可見血管壁的中層和外膜有淀粉樣物沉積，嚴重時血管壁中層彈力層消失，進而完全被淀粉物取代。淀粉樣沉積物在H-E染色時呈非結晶嗜伊紅物質，而用剛果紅染色后顯微鏡下淀粉樣物質呈桔紅色改變，偏振光顯微鏡下呈黃綠色雙折射光。

ApoE基因位于第19號染色體上，同一位基因點上有3個等位基因ε2、ε3、ε4，其編碼的蛋白ApoE2、ApoE3、ApoE4［3］，區別在于112位半胱氨酸的和158位的精氨酸，ApoE2兩個位點上編碼均為半胱氨酸，ApoE4兩個位點編碼均為精氨酸，而ApoE3則112位為半胱氨酸，158位為精氨酸。ApoE最初于正常人極低密度脂蛋白中發現，在肝臟細胞及內皮細胞合成后分泌至血漿，通過受體中介，主要存在于乳糜微粒、乳糜微粒殘基、極低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白中，參與脂蛋白代謝并起重要作用［4］。ApoE4及ApoE3能通過與低密度脂蛋白受體結合，而與升高血漿中膽固醇及低密度脂蛋白相關［5］，ApoE2雖然可與低密度脂蛋白結合，但結合活性很低，從而形成高脂蛋白血癥。本研究發現，腦出血組基因型頻率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，ε2／ε2、ε2／ε3基因型最少，通過研究等位基因發現，等位基因ε3表達頻率較正常組明顯降低，而ε4表達頻率較正常組明顯升高，等位基因ε較對照組增高，但無顯著性差異（P＞0.05），表明等位基因ε4可能為高血壓腦出血的危險因子，等位基因ε3可能為高血壓腦出血的保護因子，而等位基因ε2對高血壓腦出血的作用尚未明確，與江震欽等［6］研究結果相似。

淀粉樣腦血管病由于淀粉樣蛋白（常為β淀粉樣蛋白，Aβ）在大腦血管壁沉積并不斷替代平滑肌層，形成血管壁纖維蛋白樣壞死，微血管擴張，導致血管壁損害破裂出血［7］。β淀粉樣蛋白是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）蛋白水解作用而產生。研究發現，ApoE能與Aβ結合，進而參與調節淀粉樣蛋白的合成，形成穩定復合物，通過對不同等位基因的連接能力對比發現，ApoE4具有很強的連接能力，能促進淀粉樣蛋白形成，而沉積于血管壁，與文獻［8-10］報道相似。本研究發現，腦出血組ε4基因對腦出血Aβ16-17影響最大，其表達水平最高，而ε3基因能降低腦出血組Aβ16-17的表達，腦出血表達水平顯著低于對照組，ε2基因亦能促進腦出血組Aβ16-17的表達。

綜上，通過對ApoE的基因型頻率分布、不同等位基因頻率分布以及APP的研究發現，ApoE能通過影響APP的代謝，使淀粉樣蛋白沉積于血管壁，形成血管壁纖維蛋白樣壞死，微管擴張，導致血管壁損害破裂出血，其中Apoε4基因對腦出血的影響最大，為腦出血危險因子，而Apoε3基因為腦出血的保護因子，Apoε2基因能影響淀粉樣蛋白的代謝而促進腦出血，但其與腦出血的影響無明顯相關性，可能與Apoε2基因還可能通過其他途徑起保護作用相關，其功能有待進一步研究。雖然ApoE及腦血管淀粉樣變對腦出血有影響，但ApoE以及腦血管淀粉樣變影響腦出血的機制有待進一步研究。

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