EphrinA1-PE38／GM-CSF殼聚糖納米粒治療荷膠質瘤鼠原位激活樹突狀細胞研究

李 明陳志民吳中華孫 勇王 斌史錫文韓雙印（通訊作者）

鄭州大學人民醫院 1）神經外科 2）中心實驗室 鄭州 450003

殼聚糖（chitosan）是從甲殼類生物的貝殼中提取出來的一種可生物降解的多糖，具有良好的生物相容性，對包裹的分子有很好的結合和保護作用，對生物體無毒、相容性好，且很容易制成不同途徑給藥的基因治療載體［1］。在表面覆蓋吐溫-80的納米微粒，能很好地透過血-腦屏障，對顱內腫瘤治療具有很好前景。值得注意的是，納米粒能夠用配體進行表面修飾，如抗體片段，可進行靶向治療。EphA2屬于受體酪氨酸激酶家族，EphrinA1是其特異性的配體。在成人各種正常上皮細胞中，EphA2幾乎不表達，在能夠形成血管的膠質瘤中EphA2高表達明顯［2］。以樹突狀細胞為基礎的免疫治療是一種非常有前景的新療法，具體做法是使DCs負載腫瘤相關抗原，有效激發機體CTLs的抗腫瘤免疫反應，達到靶向性殺傷腫瘤細胞而不傷害正常細胞的目的。本研究內容主要為高性能殼聚糖包裹EphrinA1結合綠膿桿菌毒素PE38殺傷膠質細胞瘤血管生長造成腫瘤缺血、缺氧性壞死，同時聯合免疫調節劑GM-CSF在體內完成DCs抗原負載并產生DCs疫苗。

1 材料與方法

1.1 主要溶液的配制 本實驗由鄭州大學人民醫院倫理委員會批準實施，乙酸溶液的配制：取0.3mL乙酸溶于100 mL消毒去離子水，配制成0.3%，v／v。殼聚糖液的配制：取100mg殼聚糖溶于50mL上述乙酸溶液，配制成0.2%，w／v，用0.22Lm消毒小濾器過濾。

1.2 PE38殼聚糖納米顆粒制備

1.2.1 PE38殼聚糖溶液的配制：PE38溶于殼聚糖液，以空白殼聚糖液作為對照，在核酸蛋白檢測儀測得PE38濃度為2.866mg／mL，2.693A260、2.358A280、A280／A260＜1.5，蛋白 濃 度（mg／mL）＝1.55A280-0.75A260＝1.84mg／mL。

1.2.2 PE38殼聚糖納米粒的制備：取0.2mL TPP液加入0.5mL PE38殼聚糖液，室溫，高速振蕩，自動形成乳白色懸液，置于37℃的恒溫振蕩箱中，反應時間12h，然后使用高速離心機以13 000r·min-1的速度離心30min。采用細胞破碎儀將收集的納米粒分散到10mL的水中，分批加入過量的硼氫化鈉，反應時間10h，得到穩定的NPs。經離心分離、超聲分散、透析等處理，將其中的硼氫化鈉和STPP去除。取1mL的粒子經冷凍干燥后計算粒子濃度，調節粒子濃度直至達到10mg／mL以備用。

1.3 PE38-NPs的EphrinA1修飾 量取5mL 10mg／mL的NPs，加入到1mL 5mg／mL的EphrinA1溶液中，然后加入25mg的EDC，反應時間1h，即得到EphrinA1修飾的納米粒。將該粒子溶液于13 000r·min-1轉速下離心30min。沉淀重新超聲分散后備用。

GM-CSF修飾EphrinA1修飾的NPs：量取2.5mL 10 mg·mL-1EphrinA1修飾的NPs，加入25mg GM-CSF，室溫條件下反應時間4h。使用截留分子量14 000的透析袋透析，將未反應的PEG去除，得到PEG和FA修飾的NPs。

粒徑和Zeta電位表征：取制備好的NPs以純水稀釋到1 mg·mL-1，然后進行粒徑和電位分析。

1.4 荷瘤大鼠模型的構建及干預 成年的C6大鼠購自于河南省實驗動物中心，并生長于無菌的飼養環境中。用RPMI-1640和胎牛血清培養C6細胞，當細胞在培養瓶中生長至80%～95%融合時，以0.25%的胰酶消化2～3min，然后采用胎牛血清中止，加PBS液調整細胞懸液密度（1～5）×1010個／mL。在無菌條件下，取0.5mL注射至Wistar大鼠皮層，緩慢注射并留針3min。動物生長10d后模型構建成功，動物隨機分為4組：正常對照組（A組，n＝50），生理鹽水組（B組，50μg生理鹽水，n＝50），口服組（C組，50μg納米粒，n＝50）和靜脈注射組（D組，50μg納米粒，n＝50），從第10天開始，每3天重復1次相應的處理。

1.5 荷瘤大鼠的生存率的測定 為了解腫瘤生長過程中生長情況，每個時間點處理5只動物，一旦動物處死后，游標卡尺并測量腫瘤的最大直徑和最大寬徑。

1.6 免疫熒光和免疫組化 第13天時4組動物分別取3只戊巴比妥過量麻醉處死，分離腦組織，4℃多聚甲醛固定24h，放置于20%蔗糖溶液中，當腦組織沉于容器底部，作連續冰凍狀片，片厚25μm，每5張片子取一張進行免疫組化或免疫熒光染色，為鑒別腫瘤組織表達的GFAP，常規免疫熒光染色，一抗分別為羊抗GFAP，二抗為兔抗羊IgG-GFP；為計數腫瘤組織血管內皮細胞，常規免疫組化染色，一抗分別為羊抗CD31（1∶200），DAB顯色。

1.7 檢測引流淋巴結、脾臟中活化DC的比例 （CD11c＋和CD86＋）為檢測到活化的樹突狀細胞，處死大鼠后分別取頸部淋巴結、脾臟組織，剪刀剪碎，碾磨，300目濾網過濾，常規流式細胞儀（FACS Calibur）檢測活化引流淋巴結和脾臟中CD11c＋和CD86＋的比例。

1.8 統計學處理 實驗所得數據均經SPSS 13.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗（單因素或雙因素）或ANOVA（多因素）檢驗數據，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建質粒真核細胞的表達 制備得到的納米粒子是一種淡黃色帶乳光溶液。雖然制備的納米粒不是十分規則，但在掃描電鏡中觀察到粒徑均在200nm以下，見圖1。

圖1 制備的殼聚糖納米粒電鏡照片

EphrinA1、GM-CSF修飾對Zeta電位產生了強烈的影響，EphrinA1、GM-CSF修飾后Zeta電位下降十分明顯，見圖2。

2.2 腫瘤體積 4組大鼠均無死亡情況發生。隨著C6細胞植入時間的延長，腫塊組織逐漸增大，倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞生長良好。植入腫瘤細胞至第9天可見，形成約0.5cm3的腫塊組織。干預3d后，注射納米粒組、口服納米組大鼠的腫瘤體積明顯小于其他2組，以后各個時間點此情況更加明顯。見圖3。

圖2 不同修飾后納米粒電位

圖3 不同組腫瘤體積大小

2.3 免疫組化 腫瘤組織GFAP染色陽性，同時可見PE38毒素蛋白分散在血管周圍（圖4A～C）。部分腫瘤組織細胞核明顯萎縮、壞死（圖4D），CD31作為腫瘤血管的一個標記物，各組均見CD31呈陽性表現（圖4E～H），靜脈注射納米粒組CD31陽性明顯減少（圖4I）。

2.4 流式細胞儀檢測DCs的數量及活化DC的比例 正常對照組、生理鹽水組、口服納米粒組組、靜脈注射納米粒組CD11＋和CD86＋雙標術后8d較術前高，以后8、15、22、29d各個時間點，逐步下降，但較其他3組仍較高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見圖5。

3 討論

本研究結果顯示，殼聚糖包被的EphrinA1-PE38／GMCSF納米粒能有效殺傷膠質細胞瘤血管生長造成腫瘤的壞死，同時體內促進局部引流淋巴結及脾臟中樹突狀細胞活化，相當于體內形成原位樹突狀細胞疫苗。動物實驗進一步表明，此納米粒可有效提高荷瘤動物模型的生存時間。EphrinA1、GM-CSF分子鏈上沒有可以電離的基團，修飾后一般只能使Zeta電位的絕對值下降，表明此納米粒構建成功。納米粒能否通過血腦屏障是本實驗的一個中心焦點，本實驗中，我們可在腫瘤血管周圍檢測出毒素蛋白，而在其余腦組織及肝腎等組織中尚無檢測到，說明經殼聚糖包被的的納米粒能有效透過血腦屏障［3］，并可以充分發揮其毒素作用。另外，膠質瘤本身可以破壞部分血腦屏障，這也是此納米粒能有效達到腫瘤周圍的一個重要因素。

腦組織是一個免疫特免部位，無完整的淋巴系統和正常的淋巴引流，樹突狀細胞細胞能否有效殺傷膠質瘤是本次研究順利進行的一個焦點。傳統觀點認為，腦組織中缺乏DCs，但只是相對而言，多種病理情況下血-腦屏障受到破壞，淋巴細胞可以進入中樞發揮免疫作用。雖然腦內缺乏結構完整的淋巴管，但腦脊液與頸部淋巴結之間存在聯系。且越來越多的證據表明，腦組織中存在DCs或DCs的前體細胞，其可能來源于外周血，也可能由腦組織中的細胞轉化而來。我們有理由相信，抗血管治療腦膠質瘤，不但破壞了“免疫特赦”屏障，同時也激活了潛伏在腦血管周圍和蛛網膜下腔起免疫監視作用的T淋巴細胞，通過原位細胞免疫達到了靶向性腫瘤殺滅效應。本次實驗證明，經治療后荷瘤大鼠的頸部淋巴結可通過流式細胞儀雙標檢測到樹突狀細胞的標志物（CD11c、CD86＋），分析顯示干預前后差異有統計學意義，進一步驗證了樹突狀細胞可以在中樞神經系統發揮作用。

圖4 靜脈注射組腫瘤組織血管周圍分布（A-C），靜脈注射組可見腫瘤組織的細胞核皺縮（D），不同組CD31染色陽性的表現（E-H），并細胞計數（I）

圖5 不同組活化樹突狀細胞陽性細胞的計數

［1］Jung WJ，Park RD.Bioproduction of chitooligosaccharides：Present and perspectives［J］.Mar Drugs，2014，12（11）：5 328-5 356.

［2］Miki K，Nagaoka K，Harada M，et al.Combination therapy with dendritic cell vaccine and IL-2encapsulating polymeric micelles enhances intra-tumoral accumulation of antigen-specific CTLs［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（2）：499-504.

［3］Colton CA.Immune heterogeneity in neuroinflammation：dendritic cells in the brain［J］.J Neuroimmune Pharmacol，2013，8（1）：145-162.