shRNA靶向干擾Notch2對膠質瘤細胞株U87生長的體外研究

李學真 何 心 王建禎（通訊作者）

1）首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科 北京 100050 2）首都醫科大學附屬北京三博腦科醫院神經外科 北京 100093 3）武警總醫院神經外科 北京 100039

Notch信號通路是一個高度保守的細胞間信號調節傳導系統，通過特異的信號上下級聯作用影響細胞的增殖［1］。研究表明，Notch信號在膠質瘤的生長中發揮重要的作用［2-6］。但Notch信號通路在膠質瘤發生發展中的具體作用還不清楚。本實驗應用Notch2shRNA干擾質粒和相同載體的無意義序列穩定轉染人腦膠質瘤細胞株U87，觀察U87細胞株中Notch2蛋白表達持久抑制后對細胞增殖的影響，為膠質瘤的基因治療提供可靠的理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和質粒轉染 U87膠質瘤細胞株，在青霉素和鏈霉素100U／mL的10%小牛血清DMEM培養基中37℃、5%CO2以1×105／mL的接種密度接種24孔培養板過夜培養。質粒轉染過程按照Lipofectin 2000操作規程進行。同時轉染并篩選pGFP-V-RS質粒無關序列組作為對照。篩選成功后熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。

1.2 RT-PCR檢測基因沉默效果 Notch2和GAPDH引物序列：Notch2，上 游：5＇-CCCAATGGGCAAGAAGTCTA-3＇，下游：5＇-CACAATGTGGTGGTGGGATA-3＇；GAPDH：上游：5-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3，下 游：5-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3Notch2，30個循環，GAPDH 25個循環。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后紫外線下拍照比較各組灰度變化。

1.3 細胞生長抑制曲線測定（MTT法） 取3組細胞接種于96孔板，3 000個細胞／孔，每日在相同時間加入噻唑蘭（MTT），連續1周，孵育4h離心，加入（DMSO）二甲基亞砜并振蕩數分鐘，應用酶標儀檢測各孔A 490值繪制生長抑制曲線。

1.4 蛋白免疫印跡（Westen blot） 收集各組細細胞提取蛋白，Westen blot檢測干擾組與轉染無關序列組和未轉染組間Notch2蛋白及其活性片段Notch2IC的表達情況，同時檢測細胞增殖、周期相關蛋白p21、p27、CyclinD1和MCM2的表達情況。

1.5 統計學分析 利用Image-proplu（sversion5.0.2.9）軟件分析圖像，測定陽性表達區累積光密度，SPSS 13.0軟件完成數據統計處理，結果以±s表示，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效抑制Notch2的表達 RT-PCR、Western blot結果顯示，U87細胞中存在Notch2RNA及蛋白水平的表達，穩定轉染pGFP-V-RS Notch2shRNA后，與未轉染組和無意義序列組相比Notch2在RNA（圖1A）及蛋白水平（圖1B）均發生顯著抑制

2.2 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效影響U87細胞增殖、周期及相關蛋白表達 MTT結果顯示，與未轉染組和無意義序列組比較，干擾組細胞生長速度減慢，見圖2A。干擾組細胞S期細胞所占百分比明顯降低，G1期細胞所占百分比明顯升高，而組間G2期細胞所占百分比差異無統計學意義見圖2B、C。Western blot結果顯示與未轉染組和無意義序列組比較MCM2蛋白、CyclinD1蛋白在干擾組中明顯受到抑制，p21蛋白水平增高。

3 討論

研究中我們首先檢測了U87細胞中Notch2的表達情況，發現Notch2在U87細胞中存在RNA及蛋白水平的表達，這與Chen、Sivasankaran和Reichrat等［7-9］的研究結果相似。但Reichrath、Chen等［7-8］研究表明，Notch2受體在U87等不同膠質瘤細胞株表達存在差異。Xu等［10］也認為，在星形膠質細胞瘤組織中和髓母細胞瘤中Notch2蛋白表達水平顯著不同，但與Chen等研究不同，Xu等認為U87中Notch2受體呈低表達［11-12］。由此可見，Notch2在不同膠質瘤中的表達水平存在差異，說明Notch2在不同類型膠質瘤中發揮的作用也存在差異。

本實驗研究發現，Notch2受體與膠質瘤細胞株U87的增殖密切相關，干擾組細胞增殖顯著減慢。Chen等［6］研究也表明，下調Notch2的表達能夠抑制膠質瘤細胞株U87的體外增殖。Chen等［8］認為抑制Notch1和Notch2的表達均能使U87、U87細胞體外增殖減弱，其中抑制Notch2產生的細胞增殖抑制作用更加顯著。但與以上研究不同Fan、Xu等［5-6，11-12］認為，Notch2能夠拮抗Notch1的作用從而抑制瘤細胞的生長，在膠質瘤細胞株U87中增強Notch2的表達能夠抑制細胞增殖。根據這些研究我們推測，Notch2在膠質瘤細胞增殖中的作用可能是雙重性，Notch2在膠質瘤細胞中適度表達，增強或抑制Notch2的表達都會抑制膠質瘤細胞株的增殖；另外，部分學者的研究還缺乏體內研究的證據［6-7］。本研究證實，Notch2敲底后對膠母細胞瘤株U87的增殖揮顯著抑制作用，為Notch信號在膠質瘤中的作用研究提供了有力的證據。

Notch信號的下游通路的組成復雜，本研究表明，U87細胞株中Notch2蛋白被敲低后，細胞周期中S期細胞比例顯著降低，Western blot分析顯示細胞周期相關蛋白MCM2、CyclinD1表達降低，p21表達升高。很多研究表明在不同種類細胞中Notch信號的下游的效應蛋白也不盡相同，在小細胞肺癌中Notch信號激活能夠上調p21和p27的表達使細胞周期停滯［8］。在鼠角化細胞中，Notch信號通過CSL依賴的上調p21表達抑制細胞周期［4］。最近的一項研究表明，Notch信號通路能夠下調MCM2和MCM6表達阻滯細胞周期［13］。與文獻報道類似，本研究表明在U87細胞中Notch2敲底介導的細胞增殖抑制，是通過改變細胞周期相關蛋白，調控細胞周期來實現的，但Notch2對U87細胞遷移、侵襲的影響以及調控細胞周期的精確機制還需更深入研究。

圖1 Notch2-shRNA抑制U87細胞株中Notch2RNA及蛋白水平表達A：與未轉染組與無意義序列組相比，干擾組Notch2RNA顯著抑制，差異有統計學意義（F＝30.0，＊P＜0.01）；B：未轉染組與無意義序列組相比，干擾組Notch2蛋白顯著抑制，差異有統計學意義（F＝29.3，＊P＜0.01）

圖2 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效抑制U87細胞增殖的體外研究A：與無意義序列組和未轉染組相比干擾組細胞生長速度減慢，從培養第4天開始差異有統計學意義（F＝18.9，P＝0.00＜0.05）；B、C：與無意義序列組和未轉染組相比，干擾組細胞S期細胞所占百分比明顯降低（F＝40.02，P＝0.000）；G1期細胞所占百分比明顯升高（F＝43.55，P＝0.000）；而組間G2期細胞所占百分比，差異無統計學意義（F＝0.28，P＝0.76）。D、E：Western blot結果顯示，與未轉染組和無意義序列組比較MCM2蛋白、CyclinD1蛋白在干擾組中明顯受到抑制，p21蛋白水平增高（F＝23.6，P＝0.000；F＝10.56，P＝0.004；F＝19.24，P＝0.001）

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