FQ-PCR技術對診斷前驅期小兒結核性腦膜炎的臨床可行性及有效性評價

余振興

武漢市醫療救治中心 武漢 430000

結核病是人畜共患的慢性傳染病，由結核分歧桿菌感染引起，給人類健康帶來嚴重威脅。結核性腦膜炎（TM）是由結核分歧桿菌引起的腦膜非化膿性炎癥，是慢性腦膜炎的常見類型，且是所有肺外結核菌感染疾病中最嚴重的［1-2］。TM患者若未經治療，將在發病后4～8周病情加重，直至死亡。近年來，由于抗結核治療的不規范，結核多重耐藥菌株的出現導致免疫缺陷患者增加等因素使TM的發病率呈上升趨勢。同時臨床表現呈現多樣化，診斷難度增加，導致誤診率較高［3］。發展快速高效診斷TM的技術可避免因不當治療引起的藥物不良反應，并最大程度改善患者預后，降低TM的致死率和后遺癥發生率，已成為當前TM控制的當務之急。本研究通過FQ-PCR檢測34例TM患兒的TB-DNA水平，與結核涂片的結果對照，發現FQ-PCR檢測對TM具有較高的診斷價值?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012-06—2014-01在我院接受治療的34例TM患兒為觀察組。臨床表現主要為結核中毒癥狀、顱內高壓，以意識障礙、腦膜刺激征、錐體束征、腦神經麻痹及癱瘓為常見神經系統陽性體征。男22例，女12例；年齡6個月～4歲，平均（2.4±0.8）歲。有卡介苗接種25例，無卡介苗接種6例，卡介苗接種不詳3例。臨床分期：早期11例，中期14例，晚期9例。入選標準：（1）符合慢性腦膜炎的診斷標準，包括頭痛、發熱和腦膜刺激征，CSF呈非膿性炎性改變；（2）腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌墨汁染色陰性；（3）合并活動性肺炎或肺外結核；（4）影像學檢查發現顱底腦膜強化、腦積水或顱內結核瘤。排除標準：（1）病歷不全的患兒；（2）合并其他嚴重心、腎、肺等臟器疾病。另選取34例經體檢正常排除TM的患兒為對照組，經臨床檢查無肝、腎、腦和心臟等疾病。男19例，女15例；年齡8個月～6歲，平均（2.7±0.9）歲。2組患兒性別、年齡和基礎疾病等一般資料相比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患兒及家屬簽字同意。

1.2 方法 FQ-PCR法：腦脊液標本以1 500r／min離心5 min，棄上清液，沉淀物中加入50μL TB核酸提取液，輕彈管底3～5次，使沉淀物懸浮。將樣本管放置在30℃10min，隨后放置在4℃冷卻數分鐘。將樣本管10 000r／min離心5min，吸取上清，將反應模板保存在4℃內，取2μL模板上清液加入各自動反應管供PCR用。結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，FQ-PCR儀購自美國ABI公司。

涂片染色法：對腦脊液標本離心，沉渣涂片抗酸染色，鏡檢找抗酸桿菌。

1.3 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學整理和分析，計數資料行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組檢出陽性率比較 2種方法檢出陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對于TM的診斷具有更高的陽性檢出率。見表1。

表1 2組檢出陽性率比較

2.2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值比較 2種方法敏感性和陰性預測值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對TM具有更高的靈敏性。見表2。

表2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值比較 （%）

3 討論

腦膜炎是一種腦膜或腦脊膜感染疾病，通常伴細菌或病毒感染。腦膜炎患者大多數為2歲以下嬰幼兒，多出現發熱、頭痛和嘔吐、精神萎靡或愛哭鬧、頸部疼痛等。腦膜炎發病率、致死率和致殘率均相對較高，嚴重威脅患兒生命安全。且其發病機制和病理生理過程復雜，目前尚無統一的解釋［4］。腦膜炎早期臨床表現多樣化，且不典型，病情進展迅速，診斷較為困難，常常在發生不可逆的神經損傷后才被診斷出來。因此，腦膜炎的早期診斷對于其預后具有重要的價值。

在TM的診斷中，病原體的檢出為確診的金標準，目前常規的TB檢測方法為抗酸染色涂片法和培養法，抗酸染色涂片雖然簡便易行，但檢出率往往不高，報道顯示，檢出率5%～15%［5-6］。TB培養的檢出率雖然較高，然而其耗時較長，需要1～2個月才能達到預期效果，即便是快速檢測也需要1周以上，失去了TM早發現、早治療的良機。隨著分子生物學技術的快速發展，PCR技術在方法學上的優越性，已經廣泛應用于結核病的診斷中［7］。常規PCR由于存在非特異性、易污染、檢測結果需要進行溴化乙錠（EB，為強致癌物）染色等原因，造成一定的假陽性和假陰性。FQ-PCR克服了常規PCR的劣勢，通過加入熒光探針，將核酸擴增、雜交和熒光光譜技術結合起來，從而提高了檢出率和敏感性［8］。理論上只要存在一個TB菌，便能將其檢測出來，具有簡便和快速的優點，且自動化程度高，對環境污染小，適于實驗室應用［9］。

本次研究我們通過對34例TM患兒采用FQ-PCR檢測TB-DNA水平，并與傳統的涂片染色法比較，發現FQ-PCR對TM的陽性檢出率明顯更高。本次研究還顯示，FQ-PCR法的敏感性和陰性預測值高于傳統結核涂片法，說明FQPCR在TM的診斷中具有一定的價值，而其敏感性仍有待提高，且當TB-DNA陰性時也不能輕易排除TM的診斷。我們認為，本次臨床確診TM患者CSF的TB-DNA陰性的原因主要有以下幾點：（1）TM患者中TB菌株的含量較少；（2）引物和探針設計未選取最佳的特異性保守片段，細菌DNA特異序列存在部分突變，DNA提取過程中可能出現降解，細胞壁的裂解不完全導致提取的DNA量非常少，不能滿足PCR擴增模板濃度的要求；（3）患兒接受的抗結核治療起效，標本選取時間滯后，本組12例患兒是在抗結核治療實施后才抽取的CSF，而抗結核效果顯著也是TB-DNA陰性的原因之一。針對FQ-PCR敏感性不高的問題，部分學者認為可進行連續多次PCR以提高敏感性和檢出率，從而提高診斷的可靠性。因此，臨床醫師在依據患者臨床癥狀和體征表現，高度懷疑患者為TM時，可進行早期、連續的FQ-PCR以提高檢出率。

綜上所述，FQ-PCR對TM具有重要的診斷價值，敏感性高且特異性強，值得臨床進一步推廣。但仍然需要尋找對TM更為敏感的診斷方式。

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