常用抗菌藥物對常見致病菌L型誘導的實驗研究

尹秀華，王麗波，陶梅花，樊園絨，高升群，向仕輝，郭利軍

（大理學院公共衛生學院，云南大理　671000）

常用抗菌藥物對常見致病菌L型誘導的實驗研究

尹秀華，王麗波，陶梅花，樊園絨，高升群，向仕輝，郭利軍*

（大理學院公共衛生學院，云南大理671000）

目的：探討臨床常用抗菌藥物對常見致病菌L型的實驗室誘導作用，為臨床診治提供科學依據。方法：利用紙片彌散法和試管稀釋法，分別對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌進行L型菌的抗菌藥物實驗室誘導。結果：頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星均可不同程度誘導銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌形成相應的L型細菌，相同條件下金黃色葡萄球菌L型未誘導出。結論：部分抗菌藥物在一定條件下能使某些細菌失去細胞壁轉為L型菌，繼而發生生物學性狀的改變，臨床診斷治療時應給予重視。

抗菌藥物；細菌L型；實驗室誘導

［DOI］10．3969∕j．issn．1672-2345．2015．02．006

細菌細胞壁的肽聚糖結構受到理化或生物因素的直接破壞或合成被抑制，這種細胞壁受損的細菌在高滲環境下仍可存活稱為細菌細胞壁缺陷型。因其首先在Lister研究院發現而得名細菌L型。目前不合理抗生素導致細菌失去細胞壁轉變為L型菌已經成為某些疾病反復發作或遷延不愈的重要原因，人工誘導形成L型細菌的因素有很多〔1-2〕，如抗菌藥物、溶酶體等。本實驗采用了6種臨床常用的抗菌藥物，在實驗室條件下對4種常見感染性致病菌進行細菌L型誘導，現將結果報道如下。

1　材料和方法

1．1材料

1．1．1菌種金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27856、大腸埃希菌ATCC 25922、痢疾志賀菌，均由大理學院病原生物學綜合實驗室提供。

1．1．2抗菌藥物頭孢唑林（哈藥集團制藥，批號：H23020946）；頭孢哌酮（昆明積大制藥，批號：H20033229）；氨芐西林（山東魯抗醫藥，批號：H19993032）；哌拉西林（四川制藥，批號：H20061108）；左氧氟沙星（四川科倫藥業，批號：H20044291）；羅紅霉素膠囊（江蘇聯環藥業，批號：H20055965）。

1．1．3藥敏試驗紙片頭孢唑林（30 μg）、左氧氟沙星（30 μg）、羅紅霉素（15 μg）藥敏紙片，以上藥敏紙片均由北京天壇藥物生物技術開發公司提供；氨芐西林（10 μg）、哌拉西林（100 μg）、頭孢哌酮（75 μg）3種抗菌藥物的紙片均按抗菌藥物敏感性試驗紙片擴散法制備〔3〕。

1．1．4培養基采用姜孝新〔4〕報道的改良細菌L型培養基L2型：優質蛋白胨20 g、牛肉膏30 g、氯化鈉50 g、蔗糖50 g、滅活小牛血清200 mL、1 mol∕L MgSO410 mL、蒸餾水800 mL、pH 7．4～7．6，固體培養基再加入瓊脂8 g。

1．2細菌L型的誘導

1．2．1方法L型菌固體瓊脂培養基誘導法：采用藥物敏感試驗紙片彌散法進行誘導，逐日觀察抑菌圈內及邊緣生長物菌落形態及涂片革蘭染色細菌形態，連續2～3代出現典型L型菌落特征和∕或鏡下特征為誘導成功〔5〕；L型菌液體培養基誘導法：在液體培養基中的誘導采用試管稀釋法〔6-8〕，濃度選擇參考文獻〔9〕最小抑菌濃度判斷標準，起始濃度選用判斷為耐藥的最低濃度前移一個濃度。分別為：頭孢唑林（64 μg∕mL）、左氧氟沙星（16 μg∕mL）、羅紅霉素（4 μg∕mL），氨芐西林（大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌64 μg∕mL，金黃色葡萄球菌2 μg∕mL）、哌拉西林（大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌256 μg∕mL，金黃色葡萄球菌64 μg∕mL）、頭孢哌酮（128 μg∕mL）。采用藥敏試驗試管稀釋法做6個濃度，設置一個不含抗菌藥物的對照，24 h后分別取各濃度培養液涂片革蘭染色油鏡檢查，連續觀察2～3 d。

1．2．2結果判定低倍鏡觀察L型菌落典型特征：“油煎蛋”狀、顆粒狀、絲狀菌落；革蘭染色油鏡下L型菌典型特征：多形性、巨球型、長絲狀或長桿狀；革蘭染色油鏡下出現典型特征為誘導成功。

2　結果

2．1細菌L型典型菌落的形成本次實驗在細菌誘導2～3代過程中，在紙片彌散法抑菌圈內或交界處發現銅綠假單胞菌有細菌L型顆粒狀菌落、“油煎蛋”樣菌落，其余細菌菌落特征不明顯。見封三圖1～2。

2．2不同細菌形成L型菌落后的形態變化培養物涂片革蘭染色后鏡檢，可見長桿狀、長絲狀、球狀L型細菌典型特征；痢疾志賀菌、大腸埃希菌涂片后鏡下可見大量長絲狀、少量支端膨大和串珠狀改變。見封三圖3～5。銅綠假單胞菌在平板法誘導中細絲狀改變。見封三圖6。稀釋法中為長絲狀改變。見封三圖7。

2．3不同抗菌藥物兩種培養方法誘導產生L型菌結果見表1。

3　討論

多種細菌在某些理化因素作用下可以轉變為L型，由于細菌細胞壁缺損，與原菌比較細菌L型形態、染色性質、培養特性、生化反應、耐藥性等生物學性狀發生改變，加之臨床癥狀不典型難以作出正確的診斷和治療。但是，多數細菌L型仍具有一定的致病能力，在機體免疫力降低時，影響因素減弱或消除后它又能恢復而使疾病復發、惡化。目前研究發現它可引起多種感染性疾病，如呼吸道感染、消化系統感染、泌尿系感染等，且由于轉變為L型菌后致病力降低易于被忽略〔4，10〕。而針對臨床感染性疾病而言，抗菌藥物則是引發細菌轉變為L型的重要因素，本次實驗也證實這一點。在實驗中所使用的頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星、羅紅霉素都是目前常用的抗菌藥物，菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌也是常見引起臨床感染性疾病的病原體，除羅紅霉素之外的其余抗菌藥物都能使部分細菌發生L型轉變，其中大腸埃希菌和痢疾志賀菌能被頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星誘導產生L型菌，銅綠假單胞菌能被頭孢哌酮和哌拉西林誘導產生L型菌；以往研究多認為影響細菌細胞壁合成的抗菌藥物是誘導產生L型菌的主要抗菌藥物，但本次實驗中喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星也能誘導出大腸埃希菌和痢疾志賀菌的L型，而此類抗菌藥物目前廣泛應用于臨床多系統的感染性疾病，需引起重視。金黃色葡萄球菌在本次實驗中未誘導出L型，可能與實驗條件有關，但研究發現金黃色葡萄球菌L型臨床較常見〔10〕，同樣應引起重視。

表1　不同抗菌藥物兩種培養方法誘導產生L型菌

〔1〕Dienes L，Weinberger H J．The L-froms of bacteria〔J〕．Bacter-Ological Reviews，1951，15（4）:245-288．

〔2〕Allan E J，Hoischen C，Gumpert J．Bacterifal L-Forms〔M〕．San Diego:Elsevier Academic Press INC，2009．

〔3〕俞樹榮．微生物學和微生物學檢驗〔M〕．北京：人民衛生出版社，1997:452．

〔4〕姜孝新，楊祚升．改良細菌L型培養基的臨床應用〔J〕．南華大學學報，2001，29（5）:477-478．

〔5〕黃谷良，林特夫．細菌L型與疾病〔M〕．北京：學苑出版社，1991:49-60．

〔6〕倪語星，尚紅．臨床微生物學與檢驗〔M〕．北京：人民衛生出版社，2007:60-61．

〔7〕李楊，羅廷順，代欣桃，等．天南星提取物的抑菌作用研究〔J〕．大理學院學報，2014，13（2）:9-11．

〔8〕耿玲，陳俊雅，李洪文，等．紫地榆提取物體外抗菌活性研究〔J〕．大理學院學報，2014，13（10）:14-17．

〔9〕衛生部衛生監督中心衛生標準處．臨床檢驗標準匯編〔M〕．北京：中國標準出版社，2004:108-123．

〔10〕于守平，葛晨霞．細菌L型的形成機制與特性〔J〕．中國獸藥雜志，2009，43（8）:42-45．

（責任編輯李楊）

Experimental Study on Inductive Effects of Antibiotics on the Common Pathogenic L-form Bacteria

Yin Xiuhua,Wang Libo,Tao Meihua,Fan Yuanrong,Gao Shengqun,Xiang Shihui,Guo Lijun*
（College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To explore laboratory inductive effects of the commonly used clinical antibiotics on the common pathogenic L-form bacteria and to provide a scientific basis for clinical diagnosis and treatment．Methods:With the paper dispersion method and tube dilution method,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,E.coli and Shigella were induced by antibiotics in the laboratory．Results:Cefazolin,cefoperazone,ampicillin,piperacillin and levofloxacin could induce Pseudominas aeruginosa,E.coli and Shigella to some degree to form corresponding L-form bacteria．L-form Staphylococcus aureus under the same condition wasn′t induced．Conclusion:Some antibiotics under certain conditions could make some bacteria lose cell walls and become L-form bacteria,and then change their biological characteristics,which the clinical diagnosis and treatment should attach importance to．

antibiotics;L-form bacteria;the laboratory induction

R37

A

1672-2345（2015）02-0021-03

大理學院大學生科研基金資助項目（KYSX2013005）

2014-10-05

2014-11-25

尹秀華，預防醫學專業2010級本科生．

郭利軍，高級實驗師．