紫貽貝蛋白酶解過程中呈味物質釋放規律和呈味肽結構

趙 陽 陳海華 王雨生，2 劉朝龍 趙春霞

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農業大學學報編輯部，山東 青島 266109）

風味是影響食品品質的重要指標之一，酶解動物蛋白因具有自然、醇厚、濃郁的特征風味，已經逐步代替化學調味料，成為制備高檔復合調味品的重要基料［1］。紫貽貝又稱海紅，在中國資源豐富，年產量達50萬t［2］。紫貽貝的蛋白酶解液含有豐富的呈味氨基酸、呈味肽、有機酸等呈味物質，營養豐富、海鮮風味純正自然。本課題組［2］在前期研究中，已通過響應面優化了酶解紫貽貝最佳工藝條件，制得呈味物質含量較高、整體風味良好的紫貽貝酶解液，并對其中呈味物質進行了成分分析。結果發現，酶解液中呈味物質的含量隨酶解條件的改變表現出規律變化，且酶解液的風味特征與呈味肽的結構之間存在一定聯系。

關于水產蛋白，尤其是貝類蛋白酶解過程中呈味物質釋放規律的研究較少。肖如武等［3］研究表明，馬氏珍珠貝肉蛋白的酶解過程中，酶解液中游離氮基酸和可溶性氮含量增加，肽分子量降低，鮮味增強、苦味先增強后減弱。崔春［4］研究表明，海魚蛋白酶解過程中，酶解液中游離氨基酸含量持續增加，多肽、總酸、總糖含量先增加后降低。趙珊珊等［5］研究表明，不同酶解工藝條件下，游離氨基酸、呈味肽的釋放量和釋放速率不同。呈味肽結構的研究，主要集中于肉味肽的分子量分布和氨基酸測序。研究呈味肽的結構，須對其進行分離純化，其方法主要有硫酸銨鹽析、超濾法、陰離子交換樹脂分離、凝膠柱層析、高效液相質譜法等，氨基酸測序方法以基質輔助激光解析—三級四級桿/飛行時間質譜法為主。目前國內外大多研究中所采用的多肽分離純化方法較為單一，借助多種方法對多肽進行逐級分離純化的研究較少。伍彬［6］采用超濾法、大孔吸附樹脂和高效凝膠過濾色譜分離純化并鑒定了蝦頭自溶產物中的低分子量肽，結果表明鮮味肽和甜味肽分子量主要集中在1～3kDa。肖如武［1］采用超濾技術、大孔吸附樹脂、凝膠柱層析分離純化了藍蛤肉酶解產物肽，最終得到純度較高的鮮味肽，其鮮味強度為谷氨酸鈉的3倍。張艷萍等［7］對紫貽貝酶解物中的降血壓肽結構進行測定，結果表明，相對分子質量＜1kDa肽占降血壓肽總量的90.42%。以上研究，均未對呈味肽的釋放規律和結構之間的內在聯系作出深入探討。

本試驗擬研究紫貽貝酶解液中呈味物質的釋放規律，測定呈味肽結構，以探討其構效關系。以不同條件下制備的紫貽貝酶解液為研究對象，測定其總酸、總糖、三甲胺等呈味物質含量，以及肽分子量分布、氨基酸組成，結合酶解液的感官評分，研究各種呈味物質的釋放規律，并以酶解液各級純化產物的鮮味評分作為指標，借助多級超濾、凝膠柱層析和反相高效液相色譜法對海鮮風味肽進行逐步分離純化，采用超高分辨四極桿—飛行時間質譜確定海鮮風味肽的氨基酸序列，以期為紫貽貝蛋白呈味肽的制備、分離純化、結構研究及其在調味品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫貽貝：青島城陽水產批發市場購買；

中性蛋白酶：5×104U/g，石家莊市興達酶制劑有限公司；

木瓜蛋白酶：8×105U/g，鄭州坤利食品添加劑有限公司；

葡聚糖凝膠 G-25（Sephadex G-25）：瑞典 Pharmacia公司；

乙腈：色譜純，天津恒興化學試劑；

三氟乙酸（TFA）：色譜純，天津光復精細化工研究所；

肽分子量標準品：谷胱甘肽（分子量0.31kDa），血管緊張素（分子量1.30kDa），胰島素（分子量 5.81kD），溶菌酶（分子量14.00kDa），美國Sigma公司。

其它試劑：均為分析純。

1.2 試驗儀器與設備

超高分辨四極桿—飛行時間質譜儀：UHR-Q-TOF型，德國Bruker公司；

高效液相色譜：LC-20A型，日本島津公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8900型，日立高新技術公司；

酸度計：DELTA320型，瑞士Mettler-Toledo集團；

超濾裝置：EZ-FitTM型，美國 Millipore公司；

電腦紫外檢測器：HD-5型，上海青浦滬西儀器廠；

自動部分收集器：BSC-100型，上海青浦滬西儀器廠；

低速離心機：LXJ-IIB型，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫貽貝酶解液的制備 根據文獻［2］制備紫貽貝酶解液（mussel protein hydrolyses，MPHs）。取冷凍紫貽貝肉于磷酸緩沖液（pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5；0.2mol/L）中，按固液比1∶3（m∶V）進行勻漿，按酶活1∶1的比例加入一定量中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，適宜溫度酶解一定時間后，沸水浴滅酶20min，冷卻，4 000r/min離心20min，取上清液定容至500mL，即得MPHs。其中：分別在酶解時間2h、酶解溫度50℃、酶解pH 6.5的條件下，固定其中的2個因素，在酶解時間1～3h、酶解溫度40～60℃、酶解pH 5.5～7.5的范圍內，改變另外1個因素進行試驗。

1.3.2 紫貽貝酶解液中呈味物質的測定

（1）總酸的測定：根據ASTM D2942-02（2013）Standard Test Method for Total Acid Acceptance of Halogenated Organic Solvents（Nonreflux Methods）及 GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》規定的方法測定酶解液中總酸含量。

（2）總糖的測定：根據文獻［8］及 GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測定》，采用苯酚—硫酸法測定酶解液中總糖含量。

（3）三甲胺（trimethylamine，TMA）的測定：采用比色法［9］。

1.3.3 紫貽貝酶解液中的肽分子量分布和氨基酸分析

（1）肽分子量分布：根據文獻［10］，采用HPLC法測定紫貽貝酶解液中呈味物質的相對分子質量。色譜條件：Shodex KW-802.5（7.8mm×300mm）色譜柱；流動相：乙腈—水—三氟乙酸，三者體積比 45∶55∶0.1；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220nm；柱溫：30℃。相對分子質量校正曲線所用標準品：谷胱甘肽（分子量0.31kDa），血管緊張素（分子量1.30kDa），胰島素（分子量5.81kD），溶菌酶（分子量14.00kDa）。根據混合標準樣的洗脫時間得到標準曲線方程：

式中：

Mw——相對分子質量，Da；

t——出峰時間，min。

取適量酶解物，溶解后經0.45m微孔濾膜過濾，進樣分析。根據肽標準曲線測定紫貽貝酶解液中肽的分子量。

（2）氨基酸分析：總氨基酸組成、游離氨基酸組成：分別按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》、文獻［11］，采用全自動氨基酸分析儀測定。肽基氨基酸含量按式（2）計算：

式中：

X——肽基氨基酸含量，mg/mL；

X1——總氨基酸含量，mg/mL；

X2——游離氨基酸含量，mg/mL。

1.3.4 紫貽貝海鮮風味肽的分離純化

（1）紫貽貝海鮮風味肽的超濾分離：取適量在50℃、pH 6.5條件下酶解2h后的紫貽貝酶解液，采用截留分子量為10kDa的超濾膜在0.4MPa、（4±0.5）℃條件下進行分離，當截留液體積減少到原樣品液體積的10%時停止，取透過液進行下一級超濾處理，利用截留分子質量分別為5，3，1kDa的超濾膜依次進行上述操作，收集各級超濾組分，冷凍干燥后進行鮮味分析。

（2）凝膠柱層析法分離純化紫貽貝海鮮風味肽：將超濾分離所得的鮮味最高的組分配成質量濃度為40mg/mL的溶液，用Sephadex G-25凝膠柱層析（26mm×400mm）進行分離。進樣量為1.0mL，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，檢測220nm處的吸光值。對各分離組分峰進行收集，冷凍干燥后，進行風味分析，收集海鮮風味最佳的峰凍干后備用。

（3）反相高效液相色譜法分離純化紫貽貝海鮮風味肽：將凝膠層析分離得到的呈味組分溶解于90%的乙腈中，0.22μm濾膜過濾后，參照文獻［12］，采用島津 LC-20A高效液相色譜，Zorbax SB-C18（5μm，4.6mm×250mm）反相色譜柱驗證純度。

分離條件：進樣量10μL，流速0.5mL/min，A流動相，含0.1%三氟乙酸的超純水；B流動相，含0.1%三氟乙酸的乙腈；以10%B流動相等度洗脫；檢測波長220，280nm。

1.3.5 超高分辨四極桿—飛行時間質譜儀測定海鮮風味肽氨基酸序列 將反相高效液相色譜分離得到的海鮮風味肽溶解于50%乙腈溶液中（含有1‰甲酸），采用超高分辨四極桿—飛行時間質譜儀測定氨基酸序列。

操作條件：離子源：ESI；掃描模式：正離子，全掃描；掃描范圍（m/z）103～1 000；碎裂電壓：100V；毛細管電壓：4.5kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11L/min；霧化氣：2.90×105Pa。

圖1 酶解條件對紫貽貝酶解液中總酸和總糖的影響Figure 1 Effect of enzymatic conditions on the total acid and total saccharides of Mytilus edulis enzymolysate

1.3.6 感官評定 由8位經過適當培訓的感官評價員組成品嘗小組，根據文獻［13］、［14］的方法進行感官評定。對紫貽貝酶解液的各級超濾液鮮味、苦味進行評分，采用5分制，0～5分由低到高，分別代表風味程度“很弱、較弱、一般、較強、很強”。采用TDA（taste dilution analysis）法對海鮮風味肽進行評定，其中不少于6名感官評定員能夠準確評價的最高樣品濃度，即為樣品在水中的呈味閾值。

2 結果與分析

2.1 呈味物質的釋放規律

2.1.1 酶解條件對酶解液中總酸和總糖含量的影響 貝類中的酸主要包括乳酸、丙酸、琥珀酸等有機酸，具有提高酶解液緩沖能力、增強呈味特性的作用［5］。酶解液中的總糖包括以游離形式存在的葡萄糖、半乳糖、果糖等，各種糖的含量均遠低于其呈味閾值，故其對酶解液甜味的影響不大［5］。但糖與其他物質之間的相互作用可能影響酶解液的整體風味［13］。由圖1可知，隨著酶解時間的延長、酶解溫度的升高，紫貽貝酶解液的總酸含量均呈先升高后降低的趨勢，分別在酶解時間1h、酶解溫度50℃時達到最大值。隨著酶解時間的延長、酶解溫度的升高，總糖含量基本不變。隨著酶解pH的升高，總酸及總糖含量均呈降低的趨勢，當pH為5.5時，總酸、總糖含量最高，這說明較低酶解pH更利于紫貽貝肉中各種酸和糖的釋放。

2.1.2 酶解條件對酶解液中三甲胺含量的影響 三甲胺可與組織中的脂肪共同作用產生腥味，且呈味閾值較低，從而對酶解液的風味產生一定的影響［14］。由圖2可知，隨酶解時間的延長，紫貽貝酶解液中三甲胺含量呈逐漸上升的趨勢，酶解時間超過1h后，三甲胺含量的增加趨緩。隨著酶解溫度、酶解pH的升高，酶解液中三甲胺含量均呈先升高后降低的趨勢，在酶解溫度為50℃、pH為6.0時，三甲胺含量達到最大值。同時由圖2可知，紫貽貝酶解液中三甲胺含量低于1.2mg/100g。而在新鮮魚中，三甲胺可接受的最大量為10～15mg/100g［9］。因此紫貽貝酶解液中三甲胺含量在可接受范圍之內，其腥味不影響酶解液的整體風味。

圖2 酶解條件對紫貽貝酶解液中三甲胺含量的影響Figure 2 Effect of enzymatic conditions on TMA content of Mytilus edulis enzymolysate

2.1.3 酶解條件對酶解液肽分子量分布的影響 由圖3可知，隨著酶解時間的延長，分子量≥10kDa的肽比例降低，分子量5～10kDa的肽比例無明顯變化，分子量1～5kDa的肽比例先升高后趨緩，分子量＜1kDa的肽比例不斷升高。這說明酶解過程中，肽逐漸分子量逐漸降低。隨著酶解溫度的升高，分子量＜1kDa的肽比例呈先上升后下降的趨勢，而1～5kDa、分子量≥10kDa的肽比例均呈先下降后上升的趨勢，5～10kDa的肽比例無明顯變化。隨著酶解pH的升高，分子量＜1kDa的肽比例降低，分子量1～10kDa的肽比例先升高后降低，分子量≥10kDa的肽比例升高。這說明pH較低時，有利于低分子量肽的生成。酶解過程中產生的肽類物質對酶解液風味的影響，主要是部分寡肽與其他呈味物質發生相乘作用，使酶解液風味飽滿、口感協調［15］。紫貽貝酶解液中的呈味肽，很可能是分子量較低的肽。

圖3 不同酶解條件下紫貽貝酶解液中肽分子量的分布Figure 3 Effect of enzymatic conditions on molecular weight distribution of peptide in Mytilus edulis enzymolysate

2.1.4 酶解過程中氨基酸的釋放 酶解過程中，紫貽貝蛋白逐漸被水解成小分子肽和游離氨基酸。酶解液中的肽類具有復雜的呈味功能，其中鮮味肽、苦味肽、甜味肽能夠賦予酶解液協調、細膩、醇厚濃郁的整體味感；游離氨基酸主要包括鮮味氨基酸（谷氨酸、天門冬氨酸）、甜味氨基酸（蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸等）、苦味氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），呈味氨基酸的含量和比例也是影響酶解液風味的重要因素之一。

紫貽貝酶解液中，氨基酸主要有兩種類型：① 游離氨基酸；② 仍存在于未被水解的肽中。由圖4可知，隨酶解時間的延長，樣品中氨基酸種類不發生變化，但釋放的總氨基酸、游離氨基酸、肽含量變化明顯。與未經酶解的樣品相比，酶解后的樣品中總氨基酸、游離氨基酸、肽基氨基酸含量明顯升高，且所有氨基酸的含量均迅速增加。酶解1h樣品的總氨基酸、游離氨基酸、肽基氨基酸含量分別為是11.190，4.798，6.389mg/mL，比酶解前氨基酸總量分別增加了276.8%，229.5%，321.9%。隨著酶解時間的延長，氨基酸總量增加速度減緩，酶解2h后，總氨基酸、游離氨基酸總量增加緩慢，肽基氨基酸含量開始降低。

隨著酶解時間的延長，鮮味氨基酸、甜味氨基酸及苦味氨基酸含量均明顯提高。其中，大部分苦味氨基酸及甜味氨基酸的含量低于其呈味閾值，因此其含量的增加基本不影響酶解液的苦味和甜味；鮮味氨基酸含量與其呈味閾值接近，并能與鹽、有機酸發生相乘作用而明顯增加酶解液的鮮味［15］。鮮味肽、甜味肽、苦味肽含量呈先上升后下降的趨勢。

圖4 不同酶解時間后紫貽貝酶解液的氨基酸組成和含量Figure 4 Effect of enzymatic time on the composition and content of amino acids in Mytilus edulis enzymolysate

綜合比較紫貽貝酶解液的肽得率、肽分子量分布、氨基酸分析結果可知，不同酶解條件下制備的酶解液中，分子量＜1kDa的肽均占較大比例，且隨著酶解條件的變化，肽得率、肽基呈味氨基酸含量變化趨勢大致相同。趙謀明等［4］指出，分子量＜1kDa的肽具有特殊的呈味特性。由此推測，紫貽貝酶解液中具有海鮮特征風味的呈味肽，大部分是分子量＜1kDa的肽。酶解條件為2.0h、50℃、pH 6.5時，紫貽貝酶解液的肽得率、水解度和低分子量肽的比例較高，呈味物質和氨基酸的釋放較充分。在此條件下大量制備紫貽貝酶解液，進行風味肽的分離純化。

2.2 紫貽貝酶解液中海鮮風味肽的分離純化

2.2.1 紫貽貝海鮮風味肽的超濾分離 超濾膜可將紫貽貝酶解液中的肽與蛋白質等其他物質進行分離，同時將海鮮風味肽與其他分子量的肽進行分離［1］。由圖5可知，與其他分子量肽段相比，酶解原液的鮮味最低、苦味最高。超濾可明顯提升酶解液的風味，使鮮味評分升高，苦味評分降低。鮮味值隨著截留分子量的減少而呈逐漸增大的趨勢，其中1 kDa濾膜透過液的鮮味值最高，且相對原酶解液有顯著提高。苦味值隨截留分子量的減少而呈逐漸減小的趨勢，其中，10kDa超濾膜對于酶解液超濾祛苦的效果最明顯，而1kDa濾膜透過液的苦味值最低，且明顯低于原酶解液。這可能是由于酶解液中引起苦味的疏水性短肽分子量較大，截留分子量逐級減小的超濾膜可以將它們有效去除。與此同時，逐級超濾對鮮味物質起到了一定的濃縮作用，使得超濾液的鮮味值逐漸升高［14］。

圖5 各級濾膜透過液的風味分析Figure 5 Flavor analysis of Mytilus edulis enzymolysate under various ultrafiltration conditions

超濾液的風味分析結果表明，鮮味肽大量存在于1kDa濾膜透過液中，這證實了海鮮風味肽是分子量＜1kDa的肽這一推測。這與伍彬等［6］的研究結果一致。由于1kDa濾膜透過液與3kDa濾膜透過液的風味相差較小，綜合鮮味和苦味的評分，大量制備3kDa濾膜透過液用作下一步分離純化。

2.2.2 紫貽貝海鮮風味肽的凝膠柱層析分離 由圖6可知，3kDa濾膜透過液在洗脫時得到4個峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中峰－Ⅱ的風味最佳，鮮味濃郁、苦味極低；而峰－Ⅰ、峰－Ⅲ和峰－Ⅳ的鮮味不明顯，且苦味較高。故對峰－Ⅱ進行大量收集，用于反相高效液相色譜分析。

2.2.3 紫貽貝海鮮風味肽的反相高效液相色譜分析 由圖7可知，經反相高效液相色譜分析后，峰－Ⅱ組分仍然包括3個樣品峰-V、峰-VI、峰-VII，峰-VI和峰-VII在220nm和280 nm處的強度均明顯低于峰-V。經風味分析可知，峰-V的鮮味值為4.8，明顯高于峰-VI和峰-VII（2.0和1.5），故選取峰-V進行收集，用于紫貽貝海鮮風味肽的結構鑒定及構效分析。

2.2.4 UHR—Q—TOF質譜分析紫貽貝海鮮風味肽峰-V的氨基酸序列 圖8是紫貽貝風味肽峰-V的一級質譜圖，其中主要包含質荷比分別為340.760 5，679.510 3，701.492 4的3種組分。3種組分為同一種物質的3種不同表現形式，其中340.760 5是帶2個電荷的，679.510 3是單電荷形式的，701.492 4 是 ［M＋Na］峰，因 此，只 需 對 質 荷 比為679.510 3的這個肽鏈進行二級質譜分析。根據氨基酸平均分子量128可推斷，峰-V的組分是由5至6個氨基酸組成的寡肽。伍彬［6］、王娟［16］的研究也表明，凡納濱對蝦蝦頭自溶產物、金華火腿中的鮮味肽均為寡肽。

圖6 3kDa濾膜透過液的Sephadex G-25凝膠柱層析和風味分析圖Figure 6 Sephadex G-25gel chromatograms and flavor analysis of Mytilus edulis enzymolysate under 3kDa ultrafiltration conditions

圖7 紫貽貝風味肽組分峰－Ⅱ和溶劑峰的反相高效液相色譜圖Figure 7 Reversed phase high performance liquid chromatography of peak-Ⅱand solvent blank from Mytilus edulis seafood flavor peptides

圖8 紫貽貝風味肽組分峰-V的一級質譜圖Figure 8 Mass spectrum of peak V from Mytilus edulis seafood flavor peptides

圖9為母離子m/z＝679.510 3的二級質譜圖。母離子m/z＝679.510 3經碰撞誘導解離（CID）后，可能產生3種類型的碎片離子，包括序列離子、中間碎片離子和衛星離子。但是在CID的裂解能量不高時，肽鏈中的肽鍵（酰胺鍵）更易發生斷裂，從而更易產生b型離子和y型離子。結合紫貽貝海鮮風味肽的氨基酸分析結果，采用從頭測序（de novo）的方法對未知肽段進行氨基酸序列分析可知，其氨基酸序列為CSVQDQ 或 QAVNFT，即Cys-Ser-Val-Gln-Asp-Gln或 Gln－Ala-Val-Asn-Phe-Thr。經計算其相對分子質量理論值分別為121＋105＋117＋146＋133＋146－18×5＝679－1和146＋89＋117＋132＋165＋119－18×5＝679－1，與質譜測定結果一致。

Glu、Gln、Asp、Asn之間相互結合形成的短肽或它們與Gly、Ala、Met、Thr、Ser、Cys相互結合形成的多元酸鈉鹽可以呈現較為明顯的鮮味特征［17］。Cerny等［18］發現含有Glu或Asp的肽與一定濃度的鹽或味精等呈味成分有較強的協同增鮮功能。研究發現，部分游離氨基酸具有一定的鮮味特征，但其呈鮮味的特性遠低于鮮味肽，這是由于氨基酸通過肽鍵的連接后，相互作用明顯增強，從而使鮮味特性顯著提高［1，2，17］。本研 究 分 離 純 化 出 的 六 肽 Cys-Ser-Val-Gln-Asp－Gln或 Gln-Ala-Val-Asn-Phe-Thr含有以上特征氨基酸，但氨基酸序列獨特，不同于任何目前已知序列的呈味肽。

圖9 紫貽貝風味肽組分峰-V一級質譜中核質比為的679.510 3母離子二級質譜圖Figure 9 MS/MS spectrum of the precursor ion with m/zof 679.510 3from MS of peak V from Mytilus edulis seafood flavor peptides

根據TDA法分析得到紫貽貝海鮮風味肽峰-V的呈味閾值為0.1mg/mL，明顯低于谷氨酸一鈉（味精，MSG）的呈味閾值（0.3mg/mL）［19］。

3 結論

紫貽貝酶解過程中，總酸、總糖、三甲胺、多肽、氨基酸等含量的變化均遵循一定規律，其共同作用決定了酶解液的風味特征。海鮮風味肽為低分子量肽，pH較低的條件利于其生成。這為水產蛋白，尤其是貝類蛋白酶解過程中呈味物質釋放規律的研究提供了理論參考。經超濾、凝膠層析和反相高效液相色譜分離純化得到的呈味肽純度較高，此方法適用于海鮮風味肽的分離純化。海鮮風味肽的結構為Cys-Ser-Val-Gln-Asp-Gln或 Gln-Ala-Val-Asn-Phe-Thr，不同于任何目前已知序列的呈味肽。其呈味閾值明顯低于MSG，作為鮮味劑，具有潛在的應用價值。

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