5種長白山野生食用菌的抗腫瘤活性研究

李 雪 李鵬飛 李曉東 于 婷 金乾坤 崔承弼

（1.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

中國東北部長白山地區的野生食用菌共有28科82屬297種［1］，不但為該地區的人民提供了豐富的食材、藥材資源，還成為了該地區的主要經濟作物之一。常見的主要有猴頭蘑、靈芝、元蘑、黑木耳、樺褐孔菌、榛蘑等17種食用菌。其中元蘑、榛蘑、猴頭蘑被稱作東北“三大蘑”［2］。長白山野生食用菌不但具有很好的食用品質和營養價值，而且還具有一些生理活性功能，如抗氧化、抗衰老和增強免疫力等功能［3－7］。許多研究［8－16］還表明食用菌不僅含有很 高的 營養價值而且還可以作為藥物預防和治療許多疾病。

隨著時代的發展，人們生活水平提高，生活的壓力變大以及嚴重的環境污染使癌癥人群迅速增加［17］。在全世界范圍內，惡性腫瘤被公認為是僅次于心腦血管疾病的第二大致命性疾病，對于癌癥的預防與治療已經引起了國際上的普遍關注［18］。常規的手術、化療在殺傷腫瘤細胞的同時也嚴重損害宿主的免疫系統，而合成的抗癌藥對人體正常細胞可能產生毒副作用。流行病學與預防醫學研究［19］顯示，植物中存在多種天然抗癌活性成分，它們因較低的毒副作用和廣泛的來源，受到了世界范圍內的高度重視。本試驗在單一食用菌生理活性研究的基礎上，聚焦長白山5種野生食用菌，通過體外和體內試驗來測定其提取物的抗腫瘤活性，并對這5種常見野生食用菌的抗腫瘤活性進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山野生食用菌：靈芝、樺褐孔菌、桑黃、猴頭蘑、香菇，均購置于吉林省安圖縣土特產市場；

DMEM培養基干粉、胎牛血清：美國GIBCO公司；

MTT粉劑、二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司；

其他試劑：均為分析純化學試劑。

1.2 儀器設備

電子天平：JA10003N型，民橋精密科學儀器有限公司；

酶聯免疫檢測儀：DG5033A型，南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司；

CO2培養箱：MCO175型，日本三洋公司；

熒光倒置顯微鏡：CKX-41型，日本OLYMPUS公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-75S11型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗動物

SPF級Balb/c，體重18～22g，雌雄各半，由延邊大學實驗動物中心提供。動物在IVC動物實驗室適應性飼養3d，室溫20～24℃，相對濕度40%～65%，換氣次數10～20次/h，壓差20～50Pa。

1.4 試驗用癌細胞株

子宮宮頸癌細胞（HeLa）、肺癌細胞（A549）、乳腺癌細胞（MCF-7）、肝癌細胞（HepG2）、小鼠S-180肉瘤細胞株、正常腎臟293細胞：特殊腫瘤細胞株公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 野生食用菌提取物的制備 稱取5種野生食用菌各1kg，分別加70%乙醇10L，加蓋常溫下浸泡24h，加熱（90℃）回流提取2次，每次2h，趁熱過濾，合并2次濾液，濃縮沉淀，回收乙醇，熱風50℃烘干備用。

1.5.2 體外腫瘤抑制試驗方法 將子宮宮頸癌細胞（He-La）、肺 癌 細 胞 （A549）、乳 腺 癌 細 胞 （MCF-7）、肝 癌 細 胞（HepG2）在含有10%胎牛血清的DMEM培養基上培養至對數期后，將細胞的濃度調整為5×103個/mL，96孔板接種（100μL/孔），每個提取物6個復孔，并設對照孔（加DMEM培養基），在37℃、5%CO2的條件下培養24h。然后，每孔加入20μL MTT溶液，繼續培養4h。終止培養，吸去孔內培養液。每孔加入150μL二甲基亞砜，酶標儀振板10s，在波長為492nm下測定其吸光度。

1.5.3 體內腫瘤抑制試驗方法 選擇培養7～10d生長良好的S-180肉瘤瘤株，無菌取腹腔積液，用0.9%無菌生理鹽水按1∶3稀釋成瘤細胞懸液，并計數調整細胞濃度為1×107個/mL，用體重18～20g的Balb/c小鼠180只，每只0.2 mL接種至小鼠右側腋窩下方。24h后選擇狀態良好的小鼠，稱重后隨機分為18組：空白對照組和靈芝、桑黃、猴頭蘑、樺褐孔菌香菇低、中、高劑量給藥組。每組10只，各組灌胃給藥，低、中、高劑量分別為25，125，250mg/mL，連續給藥20d，空白對照組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液，停藥次日處死動物。解剖剝離瘤塊，稱瘤重，按式（1）計算腫瘤抑制率［20－23］。

2 結果分析

2.1 食用菌提取物體外腫瘤抑制試驗結果

2.1.1 提取物對HeLa細胞的生長抑制作用 由圖1可知：隨濃度的增加，各提取物的抑制效果不斷增強。在提取物濃度為1.0mg/mL時，靈芝、猴頭蘑和香菇對HeLa有70%以上的生長抑制效果，其中以靈芝的效果最為顯著，濃度在0.75mg/mL時能達到81.0%的抑制效果。在李夢媛等［24］的研究中所采用的靈芝多糖濃度在5mg/mL時，對Hela細胞的抑制率為22.9%。T.C.Finimundy等［25］測定了巴西香菇提取物對Hela細胞的抑制作用，結果顯示，22℃條件下提取的香菇提取物有最高的抑制效果，其IC50值為0.57%。與以上兩項研究的結果相比，本研究所采用的長白山地區的食用菌在抑制Hela細胞的生長方面更具優勢，且抑制效果依次為：靈芝＞香菇＞猴頭蘑＞樺褐孔菌＞桑黃。

圖1 野生食用菌提取物對人體子宮宮頸癌細胞（HeLa）的抑制Figure 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to HeLa cells

2.1.2 提取物對HepG2細胞的生長抑制作用 由圖2可知：隨著5種食用菌提取物濃度的增加，其對HepG2細胞的抑制效果逐漸增強，并且在該試驗中，以靈芝和猴頭蘑對HepG2細胞的抑制作用最為明顯，桑黃與樺褐孔菌次之，而香菇的作用最小。在濃度為1.0mg/mL時，靈芝和猴頭蘑對肝癌細胞HepG2的抑制率分別為71%和76.3%。Jong Seok Lee等［26］也做了與本試驗相似的研究，他們研究了韓國猴頭蘑對HepG2細胞的抑制作用，結果顯示猴頭蘑提取物濃度在1 000μg/mL時對HepG2細胞的抑制作用還不到40%，與本研究的結果有較大差異，推測其可能是由于采用了不同的提取方法得到了不同的活性組分導致的。在章慧等［27］的研究中，分別使用乙醇浸提與超臨界CO2萃取的方法制作了靈芝提取物，這兩種提取物濃度在100μg/mL時，對HepG2的生長抑制率分別為66.15%和78.85%，效果明顯高于本研究結果。究其原因，應該是該試驗選用的靈芝對HepG2細胞的抑制作用優于本研究所采用的靈芝，另一方面可能超臨界CO2的方法使靈芝濃縮物具有更高的抗腫瘤活性。

圖2 野生食用菌提取物對人體肝癌細胞（HepG2）的抑制Figure 2 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to HepG2cells

2.1.3 提取物對 MCF-7細胞的生長抑制作用 由圖3可知，5種食用菌提取物對人乳腺癌細胞均有一定的抑制作用，并且同樣存在一定的濃度依賴關系。與對宮頸癌細胞和肝癌細胞抑制效果不同的是，對乳腺癌細胞的抑制效果最好的食用菌并不一致。同樣濃度為1mg/mL時，桑黃的抑制率最高為81.5%，猴頭蘑和樺褐孔菌的抑制率分別為76.6%和75.1%，并且桑黃、猴頭蘑、樺褐孔菌和香菇提取物對MCF-7的抑制作用顯著高于靈芝提取物，其順序依次為：桑黃＞猴頭蘑＞樺褐孔菌＞香菇＞靈芝。李宜明等［28］測定的桑黃提取物對MCF-7的抑制作用結果是在400μg/mL時，抑制率達到最高的55.39%，濃度上升到800μg/mL時，抑制率下降到了51.55%。與本研究的結果有一定的差別，推測當濃度達到800μg/mL時，其提取物的溶解已達到飽和，和本研究的情況有所不同。

圖3 野生食用菌提取物對人體乳腺癌細胞（MCF-7）的抑制Figure 3 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to MCF-7cells

2.1.4 提取物對A549細胞的生長抑制作用 由圖4可知：5種提取物均隨著濃度的增加抑制作用不斷增強。在濃度為1mg/mL時，猴頭蘑和香菇表現出較強的抑制作用，抑制率分別為89%和81%，其他提取物的抑制率也均在50%以上，順序為猴頭菇＞香菇＞靈芝＞桑黃＞樺褐孔菌。其中靈芝提取物濃度對抑制率的影響較小，而猴頭蘑和香菇提取物濃度對抑制率的影響較大，并且在濃度為0.75mg/mL時，猴頭蘑和香菇提取物對A549細胞的抑制率已經超過靈芝。劉奔等［29］的研究也采用了香菇作為試驗材料，研究了其對A549細胞的抑制作用，但其研究主要是提取了香菇中的凋亡相關蛋白，并測定了其對A549細胞的抑制作用，結果顯示，該蛋白的濃度在30μg/mL時，A549細胞的凋亡率為30.95%。也證實了香菇對A549細胞具有促凋亡作用，與本研究的結果具有相似性，但由于其與本研究所采用的香菇提取物不同，所以結果也存在一定的差異。

圖4 野生食用菌提取物對人體肺癌細胞（A549）的抑制Figure 4 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to A549cells

圖5 野生食用菌提取物對正常腎臟細胞（293）的抑制Figure 5 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to 293cells

2.1.5 提取物對293細胞的生長抑制作用 由圖5可知，5種食用菌提取物在不同濃度下對正常腎臟細胞的抑制作用均在50%以下，說明本研究所用的5種食用菌提取物對正常細胞的毒性作用較小。

2.2 體內抗癌效果

對5種野生食用菌提取物的體內抗癌效果利用Sarcoma-180腫瘤細胞進行驗證，結果見表1。由表1可知，低劑量的桑黃提取物對S-180肉瘤的抑制率最低，為4.49%；而高劑量的猴頭蘑的抑制率最高，達到75.92%。但是由于香菇的低濃度組就已經顯示出了較高的抑制率（為69.39%），并且香菇高濃度組抑制率（為72.24%）與猴頭蘑高濃度組抑制率（為75.92%）差別不大，因此可以認為香菇提取物對S-180肉瘤的抑制效果最好。

表1 野生食用菌提取物對體內S-180腫瘤的生長抑制效果Table 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to S-180sarcoma in vivo（n＝10）

表1 野生食用菌提取物對體內S-180腫瘤的生長抑制效果Table 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to S-180sarcoma in vivo（n＝10）

＊與空白對照組相比，P＜0.05。

分組 劑量 濃度/（mg·kg－1·BW）瘤重/g抑制率/%低劑量 25 1.89±0.25＊2.45±0.27 － 22.85靈芝 中劑量 125 1.28±0.16＊ 47.76高劑量 250 1.15±0.19＊ 53.06低劑量 25 2.34±0.65 4.49桑黃 中劑量 125 1.48±0.64＊ 39.59高劑量 250 1.11±0.75＊ 54.69低劑量 25 1.71±0.72＊ 30.21猴頭蘑 中劑量 125 1.40±0.84＊ 42.86高劑量 250 0.59±0.42＊ 75.92低劑量 25 1.75±0.68＊ 28.57樺褐孔菌 中劑量 125 1.38±0.72＊ 43.67高劑量 250 0.92±0.18＊ 62.45低劑量 25 0.75±0.11＊ 69.39香菇 中劑量 125 0.72±0.18＊ 70.61高劑量 250 0.68±0.14＊ 72.24空白 －

3 結論與討論

本試驗以子宮宮頸癌細胞（HeLa）、肝癌細胞（HepG2）、乳腺癌細胞（MCF-7）、肺癌細胞（A549）、以及正常腎臟細胞293為研究對象，對5種野生食用菌提取物的體外抗腫瘤作用效果進行研究。結果發現，不同的食用菌提取物具有不同的抗腫瘤效果，并且不同腫瘤細胞均有其對應的抑制效果最好的食用菌提取物。整體看來，靈芝對HeLa及HepG2兩種細胞株的抑制效果最好，對MCF-7細胞株桑黃的抑制率最高，而猴頭菇對A549細胞顯示了最強的抑制效果。這說明不同食用菌的不同功能成分具有不同的靶向作用。并且，除靈芝外，其余4種食用菌提取物均呈現了良好的劑量－效應關系。

進一步研究食用菌經過機體的消化吸收后的抗腫瘤作用，體內抗癌結果表明：猴頭蘑高劑量組的抑瘤率最高，達到75.92%，但香菇低劑量組抑制率就達到了69.39%，高劑量時為72.24%。其他3種同樣有抑制效果，并均呈現良好的劑量－效應關系。說明5種野生食用菌提取物對S-180小鼠腫瘤細胞均有一定的抑制作用。

體內和體外試驗發現，長白山野生食用菌對體外培養的人源癌細胞具有較為明顯的抑制作用，而對人的正常腎臟細胞無明顯毒副作用，此外其對小鼠體內移植瘤同樣有明顯的抑制生長作用。與國內外相關研究的對比可以看出，本試驗的結果與國內外的研究具有相似性，均能證明野生食用菌具有一定的抗腫瘤作用，但本試驗所采用的長白山地區的野生食用菌對某些腫瘤細胞株具有更好的抑制生長效果。另外本試驗對體內生長的人源腫瘤還未進行試驗檢測，也未對其機制做更為深入的探討，在后續研究中，將會對人源腫瘤的抑制作用、臨床試驗以及其機理進行更為深入的探討。

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