微波輔助復合酶法提取草菇中的風味物質

揭廣川 陳紅杰 李必金

（1.廣東輕工職業技術學院，廣東 廣州 510300；2.江西泰來食品有限公司，江西 吉安 343700）

草菇是生長在稻草堆上的一種腐生真菌，發現于廣東曲江縣的南華寺中，又名南華菇［1］。草菇為真菌植物門真菌草菇的子實體，屬擔子菌綱傘菌科。草菇具有肉質肥嫩肉滑、味道鮮美、口感佳等特點，同時具有較高的營養價值，有“放一片，香一鍋”之美譽。草菇高溫容易開傘降低商品價值，低溫又容易自溶，目前草菇不易保藏，絕大部分是鮮食。草菇中所含的核苷酸及鮮味氨基酸等呈味成分的含量比較高，所含食用菌特有的芳香成分醇類、酮類豐富，十分適于從中提取草菇抽提物。

對草菇的提取工藝研究主要有水浸法提取和酶法提取，而微波輔助復合酶法提取草菇風味物質的研究鮮見報道。趙謀明等［2］研究利用草菇自身酶系和外加復合蛋白酶與纖維素酶的共同作用把草菇中的有效成分提取出來并部分降解為小分子的呈味物質。其最佳提取工藝條件：加水量為草菇的8倍，蛋白酶與纖維素酶的酶活比為400/200，pH值為6.0，在55℃下恒溫120min可獲得最佳提取效果。固形物提取率、蛋白提取率和蛋白水解率分別為83.5%，67.6%，28.1%，3個指標分別比對照樣（未加酶）提高了53.8%，72.4%，112.9%。

在復合酶酶解草菇之后再通過微波提取，微波能對提取體系中不同組分進行選擇性加熱，使目標組分直接從基體分離，具有較好的選擇性。微波利用分子極化或離子導電效應直接對物質加熱，而空氣和容器對微波不吸收，因此熱效率高，升溫快速均勻，大大縮短了提取時間，提高了提取效率［3－7］。據此，本研究擬在復合酶解的基礎上，增加微波提取草菇風味物質，以期達到縮短時間、降低能耗、提高提取率的目的，從而為草菇的深加工提供理論依據和試驗參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器

紫外可見分光光度計：UV-1801型，北京瑞利分析儀器公司；

電子天平：BS210型，北京賽多利斯天平有限公司；

微波化學反應儀：COOLPEX-E型，上海屹堯儀器科技發展有限公司。

1.1.2 材料與試劑

草菇：市售；

甘氨酸：分析純，廣州化學試劑廠；

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶：80萬U/g，廣州欲立寶生物科技有限公司；

食用菌水解酶1號：2萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

食用菌水解酶2號：10萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微波輔助復合酶法提取草菇風味物質的工藝流程

清洗→稱重→護色處理→打漿→調配（按液料比補足水，調整pH值，添加一定量的酶）→酶解（置于恒溫水浴鍋中，恒溫水解一定時間）→微波輔助酶解（置于微波化學反應儀中，在一定功率和溫度下，水解一定時間）→滅酶→過濾→離心分離→測定α－氨基氮含量

1.2.2 復合酶法試驗方法

（1）單因素試驗設計方案：每個酶催化反應體系都有一個最合適的底物濃度、初始pH、酶用量、溫度和水解時間。本試驗以草菇為底物，按一定的料液比，探討其它各個因素對酶水解效果的影響，以游離α－氨基氮含量為考察指標，分別確定木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、食用菌水解酶1號和食用菌水解酶2號的最佳酶解條件。① 初始pH值對水解效果的影響：料液比為1∶8（m∶V），加酶量為0.2%（m∶m），水解溫度為50℃，水解時間為120min，初始pH值分別調為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0。② 酶用量對水解效果的影響：初始pH值為5.0，料液比為1∶8（m∶V），水解溫度為50℃，水解時 間 為 120min，加 酶 量 分 別 為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（m∶m）。③ 水解溫度對水解效果的影響：初始pH值為5.0，料液比為1∶8（m∶V），加酶量為0.2%（m∶m），水解時間為120min，水解溫度分別為30，40，50，60，70℃。④ 水解時間對水解效果的影響：初始pH值為5.0，料液比為1∶8（m∶V），加酶量為0.2%（m∶m），水解溫度為50℃，水解時間分別為60，90，120，150，180min。

（2）正交試驗設計方案：在單因素試驗的基礎上，以水解液中α－氨基氮含量為指標，同時考慮酶用量、水解初始pH、水解時間和水解溫度的影響，選用L9（34）正交表進行試驗，優化提取工藝。

1.2.3 微波輔助復合酶法試驗方法

（1）單因素試驗設計方案：為進一步破壞草菇酶解液中存在的蛋白質與纖維素等不溶性物質的緊密結構，提高蛋白質的提取得率，將在酶解最佳工藝條件下得到的草菇處理液，放入微波化學反應儀中，考察微波功率、溫度和時間對處理液中α－氨基氮含量的影響。① 微波功率對水解效果的影響：微波時間為10min，溫度為60℃，功率分別為600，700，800，900，1 000W。② 溫度對水解效果的影響：微波時間為10min，功率為600W，溫度分別為40，50，60，70，80℃。③ 時間對水解效果的影響：微波溫度為60℃，功率為600 W，時間分別為5，10，15，20，25min。

（2）正交試驗設計方案：在單因素試驗的基礎上，以水解液中α－氨基氮含量為指標，同時考慮微波功率、溫度和時間的影響，選用L9（34）正交表進行試驗，優化提取工藝。

1.2.4 α－氨基氮測定 采用茚三酮法［8］。先配制甘氨酸標準儲備液（1.072g/L），再用甘氨酸標準儲備液配制濃度分別為0.00，2.00，4.00，8.00，12.00，16.00，20.00μg/mL 的α－氨基氮標準系列溶液。分別取α－氨基氮標準溶液2.00mL于試管中，分別加入顯色劑1mL，并分別放一粒玻璃球于試管口上，將試管放入沸水中，準確加熱16min，在（20±0.1）℃水浴中冷卻20min。再各加入稀釋溶液5mL，充分搖勻。用空白試管調節儀器零點，于波長570nm下，測量吸光度，繪制α－氨基氮標準曲線，計算回歸方程和線性相關系數。樣品的測定方法與標準液的一致，平行做3份。

以α－氨基氮質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，在試驗范圍內，α－氨基氮濃度與吸光值之間呈良好的線性關系，其線性方程為：y＝0.033x。

圖1 α－氨基氮標準曲線Figure 1 The standard curve ofα-Amino

2 結果與討論

2.1 復合酶法最佳工藝條件的優化

2.1.1 酶制劑對草菇水解效果的影響 由表1可知：4種酶水解產物的α－氨基氮含量不同，以食用菌水解酶1號為最高，其中木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、食用菌水解酶2號主要成分均為蛋白酶，僅有食用菌水解酶1號是以纖維素酶為主。草菇的子實體由菌蓋、菌柄、菌托組成，其中蛋白質與纖維素結合緊密，由于纖維素酶可將纖維素部分降解為葡萄糖，并有破壞菇體細胞壁的作用，可促進細胞內物質（蛋白質、多糖類、脂肪等）的溶出，因此添加纖維素酶可明顯提高草菇的固形物溶出率和蛋白溶出率，對蛋白水解有一定的促進作用。由此可知，食用菌水解酶1號的水解率較高，宜采用食用菌水解酶1號和食用菌水解酶2號的復合酶系進行水解，以提高草菇細胞壁的破碎率。

表1 不同種類酶在最佳條件下水解草菇的結果Table 1 Results of hydrolyzing the Volvariella volvaceain the optimum extraction process

2.1.2 復合酶法最佳工藝條件的確定 在單因素試驗的基礎上，以水解液中游離α－氨基酸的含量為考察指標，選擇食用菌水解酶1號的用量為草菇質量的0.2%，食用菌水解酶2號的用量分別為0.2%（1∶1）、0.4%（1∶2）和0.6%（1∶3），同時又考慮了水解初始pH、水解時間和水解溫度的影響，選用L9（34）正交表進行試驗，所有試驗均重復3次，數據取平均值，正交試驗因素水平表見表2，結果見表3。

表2 復合酶解正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal experiments of composite enzyme

表3 復合酶解正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal experiments of composite enzyme

由表3可知，以α－氨基氮作為考察指標時，各因素影響的大小為C＞D＞A＞B，即水解時間對草菇提取影響最大，初始pH對草菇提取的影響最小。在試驗范圍內，最佳提取工藝條件為C2D2A2B2。

2.1.3 驗證實驗 由表3可知，最佳組合方案為C2D2A2B2，而正交表中沒有該組合方案，為了進一步考察酶解提取工藝條件的準確性，按照最佳組合方案C2D2A2B2進行3次重復實驗，取平均值，在此最佳工藝條件下，α－氨基氮的含量為0.098 9g/100g，比所有組合方案的結果都高，說明經優化后的組合方案C2D2A2B2是準確的。

2.2 微波輔助復合酶法最佳工藝條件的優化

在單因素試驗的基礎上，以水解液中游離α－氨基酸的含量為考察指標，同時考慮微波功率、時間和溫度的影響，選用L9（34）正交表進行試驗，所有試驗均重復3次，數據取平均值，正交試驗因素水平見表4，結果見表5。

由表5可知，以α－氨基氮作為考察指標時，各因素影響的大小為A＞C＞B，即微波功率對草菇提取影響最大，微波時間對草菇提取的影響最小。在試驗范圍內，最佳微波提取工藝條件為A2C3B2，與表5中試驗號為5的方案相同，即微波功率800W，微波溫度70℃，微波時間10min。表5中試驗號為5的試驗結果α－氨基氮含量最高，也驗證了此因素水平組合為最佳提取工藝，在此最佳工藝條件下，α－氨基氮含量為0.181g/100g，比復合酶法增加了83.0%，提取率明顯提高。

3 結論

（1）本研究最大特點在于將微波與復合酶共同作用應用到草菇風味物質的提取中，提取率比只采用復合酶法提取增加了83.0%，表明微波提取破壁效果明顯，有助于酶解氨基酸、核酸風味物質的釋放。

表4 微波輔助復合酶提取正交試驗Table 4 Factors and levels in the orthogonal experiments of microwave-assisted extraction under mlti-enzyme complex

表5 微波輔助復合酶提取正交試驗結果表Table 5 Results of the orthogonal experiments

（2）采用正交試驗優化了微波輔助復合酶提取草菇風味物質的最佳工藝條件：水解時間120min，水解溫度55℃，食用菌水解酶1號和食用菌水解酶2號的用量為1∶2（m∶m），初始pH為5.5，微波功率800W，微波溫度70℃，微波時間10min。

（3）在今后的試驗需要進一步研究草菇中各種主要風味物質如特有的芳香成分醇類、酮類的提取效果和損失程度。

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