超聲波輔助提取銀杏葉中總黃酮的工藝優(yōu)化

杜若源 謝 晶 王 婷 車 旭 藍(lán)蔚青

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

銀杏（Ginkgobiloba）又名白果，屬裸子植物，素有“活化石”之稱。中國是銀杏的發(fā)源地，除黑龍江、吉林、青海、西藏外，其他各省區(qū)均有分布。全國銀杏葉產(chǎn)量2萬t以上，占世界總量的70%左右［1］。銀杏葉中含有30余種黃酮化合物和萜類、酚類、微量元素及氨基酸等有效成分，具有降低血清膽固醇、增加冠脈流量、改善腦循環(huán)、解痙、松弛支氣管和抑菌等生物作用，臨床上對治療冠心病、心絞痛、心腦血管疾病，保護(hù)肝臟，預(yù)防腦功能障礙、腦傷后遺癥和抗衰老等方面均有效果［2］。

近年來，研究者圍繞銀杏葉的抗氧化活性開展了相應(yīng)研究。銀杏葉提取物已被廣泛用來生產(chǎn)保健品及功能性飲料［3］。溫嘯等［4］研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌與銀杏葉提取物有協(xié)同作用，具有控制小鼠體質(zhì)量、降血脂、促進(jìn)膽固醇代謝的功效，可用于預(yù)防和治療高脂血癥；X.Q.Tian等［5］研究了銀杏葉中的活性物質(zhì)對小鼠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激與神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其對小鼠的認(rèn)知缺損具有良好的預(yù)防作用，且能延緩小鼠腦部海馬體的衰亡，但對將銀杏葉提取液作為天然食品保鮮劑使用的研究還不多。研究［6－8］證明，銀杏葉中的抗氧化成分對果蔬與肉類具有較好的保鮮護(hù)色作用，其中抗氧化的有效成分主要為黃酮類化合物。此外，也有部分學(xué)者開展了銀杏葉中生物活性物質(zhì)的抑菌性能研究。李虎等［9］采用抑菌圈法研究了銀杏葉黃酮粗提物對細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）與真菌（禾谷鐮刀菌、煙草赤星病菌）的抑菌性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏葉黃酮粗提物對4種菌均有一定抑制作用，其對大腸桿菌的抑制性能最強(qiáng)，對禾谷鐮刀菌與煙草赤星病菌也有較明顯的抑制效果。李焰等［10］研究了銀杏葉提取物對畜禽常見致病菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與多殺性巴氏桿菌的抑菌性能良好。隨著國家對植物源生物保鮮劑的開發(fā)研究逐漸重視，有必要開展銀杏葉天然活性成分的分離純化工藝優(yōu)化與活性物質(zhì)的綜合利用研究。

傳統(tǒng)的黃酮提取方法主要有浸漬法、回流提取法等，新興的方法主要有微波輔助提取法、超聲波輔助提取法與超臨界萃取法［11］。目前，微波輔助提取法的應(yīng)用研究還處于初始階段，且操作過程需要嚴(yán)格把控時間；超聲波輔助提取法所用儀器簡單，自動化程度極高，便于大規(guī)模生產(chǎn)使用［12］。因此，已有相關(guān)學(xué)者采用此法分別從紫蘇葉［13］、辣椒葉［14］、沙棘葉［15］、甜蕎麥［16］與松籽殼［17］中提取總黃酮。本研究擬采用超聲波輔助乙醇浸提法提取銀杏葉中的生物活性物質(zhì)，課題組在前期選取乙醇濃度、固液比與提取時間進(jìn)行銀杏葉中總黃酮提取量單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，開展三因素三水平的L9（33）正交試驗(yàn)，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為后期實(shí)現(xiàn)植物源產(chǎn)品的高值化開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)與參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

銀杏葉：于2014年6月摘自上海海洋大學(xué)校園主環(huán)路上，新鮮，無病蟲害。

1.1.2 藥品試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（蕓香葉苷）：含量≥98%，上海維編科貿(mào)有限公司；

乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

超聲波清洗器：SB-25-12DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：HC-500T2型，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9053A型，上海一恒科科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：V-5100型，上海元析儀器有限公司；

隔膜真空泵：GM-0.33A型，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

精密電子天平；XS 225A型，普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁（蕓香葉苷）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 參考文獻(xiàn)［18］方法配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取5.0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用濃度為70%乙醇溶液溶解，并定量轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，稀釋至刻度，配置成濃度為0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，分別置于7個10mL具塞試管中，加入70%乙醇至2mL，再加5%NaNO20.3mL，搖勻，放置 6min；加 10%Al（NO3）30.3mL，搖勻，放置6min；加10%NaOH 3.0mL，搖勻后放置15min，以試劑空白作為參比，在510nm處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得回歸方程：Y＝9.406 8X－0.004 7，R2＝0.995 8。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Rutin standard curve

1.2.3 銀杏葉黃酮粗提液提取 將銀杏葉用蒸餾水洗凈，時間控制在3～5min，以免有效成分流失，洗凈后置于65℃烘箱中烘干至水分含量低于10%，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，得干燥粉末。以70%乙醇按固液比1∶20（m∶V）在60℃下超聲（400W）提取40min，真空抽濾后濾液即為銀杏葉提取液樣品。

1.2.4 銀杏葉粗提液中的總黃酮含量測定 取1mL樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法測定提取液在510nm條件下的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出1mL中樣品的總黃酮含量，按式（1）計(jì)算得到黃酮提取量值。

式中：

X——黃酮提取量，mg/g；

m——超聲后1.0mL樣品中的總黃酮含量，mg/mL；V——提取液的總體積，mL；

M——稱取的銀杏葉干粉質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用超聲輔助乙醇法進(jìn)行銀杏葉中總黃酮提取的過程中，多種因素如乙醇濃度、固液比、提取時間、提取溫度、超聲波頻率、樣品采摘時間與破碎程度等都會對總黃酮提取量產(chǎn)生影響。根據(jù)馮金霞等［6］的研究結(jié)果，本課題組以乙醇濃度70%，固液比1∶20（m∶V），浸提時間45min為基礎(chǔ)條件，分別選擇乙醇濃度、固液比與提取時間3個因素作5個水平的單因素試驗(yàn)，進(jìn)行銀杏葉中總黃酮的提取。

（1）提取溶劑濃度單因素試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取3.0g銀杏葉干品，置于200mL燒杯中。在恒定固液比1∶20（m∶V），浸提時間45min的條件下，分設(shè)30%，40%，50%，60%，70%共5個濃度梯度進(jìn)行提取。取一定量樣品，測其黃酮含量，計(jì)算銀杏葉中總黃酮的含量，通過總黃酮提取量的高低確定最佳提取溶劑濃度。

（2）固液比單因素試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取3.0g銀杏葉干品，置于200mL燒杯中。在恒定乙醇濃度70%，浸提時間45min的條件下，分別使用固液比為1∶15，1∶30，1∶35，1∶40，1∶50（m∶V）進(jìn)行提取。取一定量樣品，測出黃酮含量，計(jì)算銀杏葉中總黃酮的含量，通過總黃酮提取量的高低確定最佳固液比濃度。

（3）提取時間單因素試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取3.0g銀杏葉干品，置于200mL燒杯中。在恒定乙醇濃度70%，固液比1∶20（m∶V）的條件下，分別選擇30，45，60，75，90min進(jìn)行提取。取一定量樣品，測出黃酮含量，計(jì)算銀杏葉中總黃酮的含量，通過總黃酮提取量的高低確定最佳提取時間。

1.2.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以黃酮提取量為評價指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以獲得銀杏葉中總黃酮的最佳工藝條件。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3次平行試驗(yàn)的平均值，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用 Origin 8.0進(jìn)行繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。組間分析采用t－檢驗(yàn)，顯著性界值以P＜0.01為極顯著，P＜0.05為顯著，P＞0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑濃度單因素試驗(yàn) 由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，銀杏葉中總黃酮的提取量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，因此選擇乙醇濃度50%，60%，70%作為正交試驗(yàn)中乙醇濃度的3個水平。

2.1.2 固液比單因素試驗(yàn) 由表1可知，在一定范圍內(nèi)，總黃酮提取量與固液比呈正相關(guān)。當(dāng)固液比達(dá)到1∶30（m∶V）時，銀杏葉中黃酮提取量明顯上升。隨著固液比的增加，黃酮提取量顯著提高。但從經(jīng)濟(jì)適用角度上考慮，并非液料比越高越好。因此選擇固液比1∶30，1∶40，1∶50（m∶V）作為正交試驗(yàn)中固液比的3個水平。

2.1.3 提取時間單因素試驗(yàn) 由圖3可知，隨著提取時間的延長，銀杏葉中總黃酮的提取量出現(xiàn)先上升后下降的特點(diǎn)。當(dāng)提取時間為60min時，銀杏葉中的黃酮提取率最高。從正交試驗(yàn)的因素選取原則與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的可行性方面綜合考慮，最終選擇提取時間30，45，60min作為正交試驗(yàn)中提取時間的3個水平。

圖2 乙醇濃度對銀杏葉總黃酮提取量的影響Figure 2 Effects of ethanol concentration on total flavonoids yield fromGinkgo bilobaleaves

表1 固液比對銀杏葉總黃酮提取量的影響Table 1 Effects of solid-liquid ratio on total flavonoids yield fromGinkgo bilobaleaves

圖3 提取時間對銀杏葉總黃酮提取量的影響Figure 3 Effects of extracting time on total flavonoids yield fromGinkgo bilobaleaves

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度、固液比與提取時間中有意義的水平（表2），采用L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助乙醇提取銀杏葉總黃酮的最佳提取條件。正交試驗(yàn)的結(jié)果見表3，方差分析見表4。

綜合表3、4可以看出：影響總黃酮含量的各因素水平按強(qiáng)弱順序排列：A2＞A1＞A3，B3＞B2＞B1，C3＞C1＞C2。乙醇濃度對銀杏葉中總黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），固液比對其總黃酮提取率的影響顯著（P＜0.05），提取時間對提取率的影響不顯著（P＞0.05）。各試驗(yàn)因素對其影響主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即乙醇濃度＞固液比＞提取時間。綜合以上分析，乙醇浸提銀杏葉黃酮最佳因素水平為A2B3C1，即乙醇濃度為60%，固液比為1∶50（m∶V），提取時間為30 min。同時，通過對各影響因素與空列組R值的比較，發(fā)現(xiàn)因素C的R值略低于空列組。可能是由于在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對銀杏葉黃酮提取量有影響的其他因素，如提取溫度、超聲波頻率或樣品破碎程度等有所忽略。對此，課題組還將在后期進(jìn)一步增加正交試驗(yàn)的影響因素，并結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行因素間差異性大小的比較分析。

表2 因素水平表Table 2 Factors of orthogonal experiment for extracting total flavonoids fromGinkgo bilobaleaves

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of orthogonal experiment

3 結(jié)論

（1）在前期單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)得出，采用超聲波輔助乙醇浸提法提取銀杏葉總黃酮的3個影響因素的主次順序依次為：乙醇濃度＞固液比＞提取時間。最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，固液比為1∶50（m∶V），提取時間30min。

（2）在最佳工藝條件下進(jìn)行銀杏葉總黃酮的提取，其浸提物中的總黃酮含量為8.075mg/g，提取率為80.75%。通過與楊港堅(jiān)等［19］采用超聲輔助水提法相比，總黃酮的提取率已有明顯提高。劉海鵬等［20］采用超聲波提取銀杏葉中總黃酮的最佳得率為96%，但因其工藝過程需回流提取3次，且乙醇濃度為95%，工業(yè)生產(chǎn)上成本較高，操作工藝相對較復(fù)雜。因此，本法具有提取時間短、成本低、提取率高等特點(diǎn)，將能為后期銀杏葉的開發(fā)利用提供更加廣闊的發(fā)展思路。

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