芝麻油脫臭餾出物中甾醇的兩種提取工藝優化

馬素換 汪學德 李夢華

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

植物甾醇是一種重要的生理活性物質，對人的生理作用非常有益，它是植物油中一種重要的不皂化物。脫臭餾出物中含10%～30%的不皂化物，其中40%左右為甾醇［1－3］，因此多從脫臭餾出物中提取甾醇。常規的化學提取方法雖設備簡單，但耗費溶劑量大，生產廢料多，能量消耗大；新型超臨界流體萃取法，環保干凈，提取率高，但很多分子結構比較接近的物質會同時被萃取出來，造成產品純度低［4－7］。本研究擬針對以上兩種方法缺點，以芝麻油脫臭餾出物為原料，參照前人［8，9］研究的結果，在單因素試驗的基礎上，采用正交方法分別對溶劑法和超臨界CO2法兩種方法進行了工藝優化，使其更能廣泛應用于生產上和實驗室研究中，也以期為芝麻油脫臭餾出物的開發利用以及植物甾醇的生產加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設備

超臨界CO2設備：Helix-7409型，美國應用分離公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：7890A-5975C型，美國Agilent公司；

分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

可見分光光度計：722N型，上海精科公司；

循環水式多用真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義予華有限責任公司；

旋轉蒸發器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫干燥箱：XMTD-8222型，上海精宏設備有限公司；

恒溫水浴鍋：XMTE-8112型，北京市永光明醫療廠。

1.1.2 試劑

氫氧化鉀、石油醚：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；

正己烷：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

谷甾醇：純度＞75%，Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；

1.2 溶劑法提取單因素試驗

（1）皂化時間對甾醇提取率的影響：在皂化溫度85℃，加堿量7.5mL/0.5g，皂化時間1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.5h下考察皂化時間對甾醇提取率的影響。

（2）皂化溫度對甾醇提取率的影響：在皂化時間3.5h，加堿量7.5mL/0.5g，皂化溫度65，70，75，85，90，95℃下考察皂化溫度對甾醇提取率的影響。

（3）加堿量對甾醇提取率的影響：在皂化時間3.5h，皂化溫度85℃，加堿量5.0，6.5，7.5，8.5，10.0mL/0.5g下考察加堿量對甾醇提取率的影響。

單因素試驗采用以下試驗操作進行，以植物甾醇質量濃度為考察指標，每次試驗做3次平行試驗，結果取平均值。

試驗操作：準確稱取0.5g脫臭餾出物于錐形瓶中，加入一定量2mol/L KOH—無水乙醇溶液，劇烈振搖。在一定的溫度下進行水浴皂化，皂化時間到達后加入5mL蒸餾水，使其停止皂化，取出錐形瓶，冷卻至室溫，加入5mL正己烷，進行萃取，避免劇烈搖晃而致使乳化，用同樣量正己烷同樣步驟萃取3次。

合并3次萃取液，加蒸餾水水洗至中性，加入一定的無水硫酸鈉，放置一段時間除出殘留水分，將萃取液倒入圓底燒瓶中，旋蒸除去溶劑［10－12］。用少量無水乙醇復溶，轉移到100mL容量瓶中，定容。

用移液槍取出2mL于玻璃試管中，再各加入2mL無水乙醇和2mL顯色劑，在渦旋混合器上渦旋30s，靜置，顯色15min后測吸光度。吸光度測定借鑒參考文獻［9］。

1.3 超臨界CO2法提取

1.3.1 工藝流程

芝麻油脫臭餾出物→稱量上樣→超臨界CO2動靜態結合萃取→餾出物萃取率分析

1.3.2 植物甾醇萃取率計算 按式（1）進行。

1.3.3 萃取法單因素試驗設計 在CO2流量為20L/h，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為50℃，萃取時間為2.5h的基礎上從CO2流量、萃取壓力、萃取溫度和萃取時間4個因素去考查對甾醇提取率的影響［8］，各因素水平見表1。

表1 SCF－CO2萃取試驗因素水平表Table 1 SCF－CO2extraction experiment factors level table

1.3.4 氣質色譜分析條件

（1）色譜條件：HP-5毛細管色譜柱（30m×250μm×0.25μm）；進樣口溫度280℃；不分流；流速1.2mL/min；升溫程序：90℃保持1min，以30℃/min的速率升溫至270℃，保持1min，以3℃/min的速率升溫至300℃，保持12 min；進樣量1μL。

（2）MS條件：傳輸線溫度250℃，離子源溫度220℃，離子化模式為EI，電子能量70eV，分子離子碎片掃描范圍（m/z）50～650。

2 結果與分析

2.1 溶劑法提取甾醇條件的選擇

2.1.1 皂化時間對甾醇提取的影響 由圖1可知，隨皂化時間的延長甾醇得率提高，當皂化時間為3.5h時甾醇得率最高，為7.11%，但是皂化時間過長得率又會降低，因為皂化時間過長時會發生其他化學反應，溶出的物質與萃取劑漸漸結合，一方面影響甾醇的純度，另一方面使最終結果偏低。而皂化時間過短時，皂化會不完全，甾醇不能從脫臭餾出物中完全脫離出來，并且游離脂肪酸、甘油酯等能溶解于正己烷使樣品量偏高，從而使總甾醇含量較低。

圖1 皂化時間對總甾醇含量的影響Figure 1 Saponification time on the influence of total sterol content

2.1.2 皂化溫度對甾醇提取的影響 由圖2可知，隨皂化溫度的升高甾醇得率增加，從65℃到75℃變化幅度較小，75℃到85℃變化幅度較大，當溫度達到85℃時得到的甾醇最多，溫度繼續升高時甾醇含量降低，且降低速度較快，幅度較大，皂化溫度的影響和皂化時間的影響相似。這可能是由于溫度較低時物質活性低，不能皂化完全，皂化后溶液顏色加深，呈深褐色，萃取時溶劑的顏色也很深，為黃褐色，雜質進入甾醇中使結果偏低；溫度過高時又可能使甾醇發生氧化，總甾醇含量減少。

2.1.3 堿液量對甾醇提取的影響 由圖3可知，隨加堿量的增加總甾醇量增多，加堿量為5.0，6.5mL/0.5g時差別不大，加堿量從6.5mL/0.5g到8.5mL/0.5g時甾醇得率增高較快，加堿量為10mL/0.5g比加堿量為8.5mL/0.5g得到的甾醇還要少一些，這是因為加堿量過少時不能使脫臭餾出物中的甾醇完全脫離出來，甾醇得率較低，若加堿量太高，甾醇損失也較多。為避免試劑的浪費和提高產率，應將料液比定為8.5mL/0.5g。

圖2 皂化溫度對總甾醇含量的影響Figure 2 Saponification temperature on the influence of total sterol content

圖3 加堿液量對總甾醇含量的影響Figure 3 Alkaline effects on total sterol content

2.2 溶劑法正交試驗優化結果

在單因素試驗基礎上，對皂化時間、皂化溫度、堿液量進行三因素三水平正交試驗設計，設計與結果見表2。

由表3可知，各因素對甾醇提取率影響的先后順序：A＞C＞B，最優組合為A2B2C2，而9組試驗最佳結果是8.58%，其組合為A2B1C2總甾醇含量能達到8.58%，提取率為27.16%，對組合 A2B2C2進行驗證其總甾醇含量能達到8.63%，提取率為27.32%，考慮到降低熱量消耗，同時提取結果又相對比較好，所以提取甾醇的最佳條件為組合A2B1C2：皂化時間3.5h，皂化溫度80℃，加堿量8.5mL。時間越長、溫度越高、堿液量越多，但甾醇得率不一定越好，因為這些條件的提高可能會使原料發生變化，部分雜質溶解在萃取劑中被萃取出來，使甾醇的純度降低，同時降低了總甾醇含量。

表2 溶劑法正交L9（33）試驗因素水平Table 2 Solvent method of L9（33）orthogonal test factors

表3 溶劑法正交L9（33）試驗結果與分析Table 3 Results of solvent method of L9（33）orthogonal test

2.3 超臨界CO2法提取甾醇條件選擇

2.3.1 萃取壓力對甾醇提取的影響 由圖4可知，隨著萃取壓力的不斷升高，甾醇提取率先增高后降低，在萃取壓力為25MPa時，甾醇提取率最高，然后隨著壓力的增加，提取率反而下降，故選取萃取壓力25MPa。

圖4 萃取壓力對甾醇提取率的影響Figure 4 Extraction pressure impact on sterol extraction

2.3.2 萃取時間對甾醇提取的影響 由圖5可知，在萃取壓力、溫度和CO2流量一定的條件下，隨著萃取時間的延長甾醇萃取率有明顯增高的趨勢，超過3h，提取率開始下降。

2.3.3 CO2流量對甾醇提取的影響 由圖6可知，隨著CO2流量的變化，甾醇萃取隨之有明顯的變化，流量大于20 L/h時，隨著CO2流量的增加呈下降趨勢，CO2流量大時流速大，會有部分物料隨著CO2帶出，從而導致物料中甾醇的部分損失，所以CO2的流量不能過大。

2.3.4 萃取溫度對甾醇提取的影響 由圖7可知，在相同壓力下，隨著溫度的不斷升高，CO2溶解能力先升高后降低，萃取溫度為50℃時，甾醇提取率達最大值。溫度繼續升高，CO2溶解能力反而變小。

圖5 萃取時間對甾醇提取率的影響Figure 5 Extraction time impact on sterol extraction yield

圖6 CO2流量對甾醇提取的影響Figure 6 CO2flow impact on sterol extraction

圖7 萃取溫度對甾醇提取率影響Figure 7 Extraction temperature on sterol extraction yield

2.4 超臨界萃取法正交試驗結果與分析

超臨界CO2萃取法正交因素水平和結果見表4、5。

表4 超臨界CO2萃取正交L9（34）試驗因素水平Table 4 The L9（34）orthogonal experiment test factors for supercritical CO2extraction

表5 超過臨界CO2萃取正交L9（34）試驗結果與分析Table 5 The L9（34）orthogonal experiment results for supercritical CO2extraction

由表5可知，各因素甾醇的提取率影響的主次順序為：D＞C＞A＞B，最佳水平組合為A2B1C3D3，對其進行驗證并與組合A2B1C2D3進行比較，結果為甾醇提取率分別為73.25%和72.69%，故超臨界CO2最佳提取條件為：壓力25 MPa，時間為2.5h，CO2流量為25L/h，溫度為55℃。

2.5 芝麻油脫臭餾出物中甾醇的組成測定

色譜分析結果見圖8，3個主峰依次為菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇。菜油甾醇前面那個小峰為菜籽甾醇，采用面積歸一化方法，測定了各甾醇組分的質量分數，結果為菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜籽甾醇含量分別為19.32%，19.16%，42.40%，1.40%，甾醇純度為82.28%。

3 結論

從芝麻油脫臭餾出物中提取植物甾醇其溶劑法的優化工藝條件為：皂化時間3.5h，皂化溫度80℃，加堿量8.5mL/0.5g；超臨界CO2萃取法優化工藝條件為：壓力25 MPa，時間2.5h，CO2流量25L/h，溫度55℃，此條件下產品的純度為82.28%。

圖8 甾醇氣質色譜Figure 8 GC—MS pattern of standardized phytosterol

溶劑法每個操作過程會一定程度造成甾醇含量的損失，從試驗結果也驗證了溶劑法提取效果不如超臨界CO2萃取法，但SCF—CO2法應用成本比溶劑法高，能否降低使用成本將直接影響其在工業生產中的廣泛應用，未來將會嘗試用夾帶劑對超臨界萃取過程進行強化，進一步縮短萃取時間，降低操作壓力，降低其應用成本。

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