無蠟質芥藍突變型葉表面蠟質超微結構觀察

張德雙趙學志孫 雷，2張鳳蘭何洪巨汪維紅蘇同兵盧桂香

于拴倉1余陽俊1趙岫云1

（1北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；2煙臺大學，山東煙臺 264005）

無蠟質芥藍突變型葉表面蠟質超微結構觀察

張德雙1趙學志1孫 雷1，2張鳳蘭1何洪巨1汪維紅1蘇同兵1盧桂香1

于拴倉1余陽俊1趙岫云1

（1北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；2煙臺大學，山東煙臺 264005）

以亮葉無蠟質紫色芥藍突變型紫.中花芥藍和多蠟質紫色芥藍野生型為試材，對芥藍葉片發育過程中最外層的表面蠟質進行系統地觀察，并對無蠟質突變型紫.中花芥藍、多蠟質野生型芥藍和普通綠色芥藍（CK）的干物質量、VC、可溶性糖、粗纖維、蛋白質、花青苷等主要營養成分含量進行測定分析。結果表明：在葉片發育過程中，多蠟質野生型芥藍的葉面蠟質明顯多于無蠟質突變型紫.中花芥藍；野生型芥藍和紫.中花芥藍葉片背面的蠟質均明顯多于葉片腹面；野生型芥藍葉片背面的蠟質退化速度明顯慢于葉片腹面。無蠟質突變型紫.中花芥藍的VC含量高于野生型芥藍，而粗纖維（DW）含量低于野生型芥藍，說明紫.中花芥藍有利于改良現有芥藍的營養品質，有望育成高VC含量、高花青苷含量、以生食為主的芥藍品種。芥藍葉片的無蠟質性狀對多蠟質表現為隱性遺傳，紫色對綠色表現為顯性遺傳。

芥藍；無蠟質突變體；超微結構；花青苷

芥藍（Brassica alboglabra L. H. Bailey）是十字花科蕓薹屬甘藍種一年生或兩年生草本植物，原產于我國華南地區，為我國著名的特產蔬菜之一。芥藍栽培歷史悠久，不僅深受國內消費者喜愛，還出口到日本及東南亞地區。芥藍多以幼嫩、肉質的花薹和嫩葉為主要食用器官，肉質脆嫩清甜，營養豐富，富含硫代葡萄糖苷（Glucosinolate），尤其是4-甲基硫氧丁基硫苷（Zhang et al.，1994）。因此，芥藍在營養品質、蘿卜硫素提取及食品加工業等領域有著重要的研究價值。

植物葉片表皮細胞外覆蓋表皮，表皮由3層明顯的結構組成，最內層為表皮層（Cuticular layer，CL），由角質、角質層內蠟質和多糖組成；中間層為角質層本體（Cuticle proper，CP），由表面蠟質、角質層內蠟質和角質組成；最外層為平滑、結晶的表面蠟質（Epicuticular waxes，EW），具有很高的疏水性（圖1）。植物葉表面的蠟質主要為特長鏈飽和脂肪酸的衍生物，在表皮細胞的內質網上合成，具有防止非氣孔的水分散失、病蟲害的侵入和太陽光輻射等生物學功能。

圖1 植物葉表皮橫斷面示意圖（Bernard & Joubès，2013）

自然界中已發現的植物葉表無蠟質突變體較多，研究者普遍關注控制蠟質合成的相關基因，但有關無蠟質突變體葉表面蠟質超顯微結構的報道較少，尤其研究無蠟質芥藍突變體的報道更少。普通芥藍的葉表面均覆有不同程度的蠟質，當用手涂抹葉片表面后，蠟質便可部分減少。無蠟質亮葉型芥藍最早由初蓮香等（1998）報道，來源于無蠟質亮葉結球甘藍，采用香港白花普通芥藍為母本與無蠟質亮葉結球甘藍父本雜交，F1與香港白花回交、再自交，經連續轉育5代，并通過反復選擇而育成。無蠟質亮葉型芥藍豐富了芥藍種質資源，在增加芥藍產量等方面具有十分重要的意義。同時，無蠟質亮葉結球甘藍突變體也具有一定的抗蟲性（Lin et al.，1984；Stoner，1990）。

對蠟質突變體的葉表面超微結構進行研究，有助于了解突變型蠟質的發生機制以及蠟質的發育過程。本試驗以亮葉無蠟質紫色芥藍突變型紫.中花芥藍和多蠟質紫色芥藍野生型為試驗材料，對芥藍葉片最外層表面蠟質的發育過程及變化情況進行系統地觀察和比較，以期在超顯微水平上解析無蠟粉芥藍突變體的葉表面結構；同時，測定了無蠟質紫色芥藍突變型紫.中花芥藍、多蠟質紫色芥藍野生型和普通綠色芥藍葉片的水分、干物質量、VC、可滴定酸、可溶性糖、粗纖維、蛋白質、花青苷等主要營養成分的含量，旨在為亮葉無蠟質紫色芥藍在芥藍育種中的應用及盡快選育出亮葉無蠟質紫色芥藍一代雜種提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亮葉無蠟質紫色芥藍突變型紫.中花芥藍來源于多蠟質臺選中花芥藍×紫甘藍的F1與臺選中花芥藍（為父本）連續回交5代（每代均進行綜合性狀篩選）的回交群體中發現的突變型個體，自交后性狀穩定遺傳，主要表現為：植株葉表面光亮，有光澤，無蠟質覆蓋，葉片薄而質地脆嫩，葉片、葉脈、菜薹均為紫色，且營養品質優良，又具有一定的抗性；多蠟質紫色芥藍野生型是臺選中花芥藍×紫甘藍的F1與臺選中花芥藍（為父本）連續回交5代（每代均進行綜合性狀篩選）獲得的自交系，主要表現為：葉片多蠟粉覆蓋，灰綠色，葉脈、菜薹均為紫色；普通綠色芥藍（CK）為臺選中花芥藍人工自交授粉5代的自交系。上述材料均來源于北京市農林科學院蔬菜研究中心大白菜課題組。

2014年1月5日，在日光溫室中播種芥藍材料，3月15日定植到日光溫室，開花后采用人工授粉方式獲得自交種子。同時，以紫.中花芥藍為母本，以普通多蠟質綠色芥藍為父本進行雜交，獲得F1種子。8月20日，在大棚中繼續播種芥藍材料，9月10日定植到四季青農場（露地），采用噴灌澆水，保持土壤濕潤，9月30日追1次復合肥；10月20日調查紫.中花芥藍突變型和野生型芥藍、普通綠色芥藍的葉片和菜薹顏色、蠟質有無等性狀，初步研究芥藍紫色和蠟質的遺傳規律。

1.2 試驗方法

1.2.1 超微結構觀察 2014年4月，在日光溫室中播種無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍，待芥藍齊口期，分別選取無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍自交系4個發育階段的葉片，即新葉、初生葉、次生葉和老葉。分別在中國農業科學院農產品加工研究所和北京生物技術研究中心電鏡室進行觀測，掃描電鏡樣品制作方法參考牟香麗等（2013）的方法并加以改進：用流水多次沖洗芥藍新鮮葉片，再用ddH2O水清洗，以保證葉片表面干凈；避開葉脈部分，用剪刀將葉片切成長方形小塊，并用鑷子擺放在覆有濾紙的干燥器中（濾紙上記有編號），將貯有四氧化鋨的小瓶放在干燥器內，密閉熏蒸樣品72 h，晾干；最后，采用E-1010（HITACHI）型離子濺射鍍膜儀鍍金膜，利用S-3400N和S-450（HITACHI）型掃描電子顯微鏡對樣品葉片腹面、背面的蠟質結構進行觀察。

為了加強四氧化鋨熏蒸效果，四氧化鋨需要裝在開口的小容器內，并同樣品一起放于密閉的干燥器中（圖2）；樣品應該盡量小，這樣不僅保證了樣品熏蒸和干燥充分，而且樣品也不容易卷曲，不會影響觀測結果。

圖2 四氧化鋨熏蒸樣品

1.2.2 營養品質測定 2013年10月，選取在露地種植的無蠟質突變型紫.中花芥藍、多蠟質野生型芥藍和普通綠色芥藍（CK），每份材料3株，混合取樣，送交農業部蔬菜種子質量監督檢驗測試中心，測定水分、干物質量、VC、可滴定酸、可溶性糖、粗纖維、蛋白質和花青苷等營養成分含量，樣品的全部成分測定結果于2014年完成。

2 結果與分析

2.1 無蠟質突變型與多蠟質野生型芥藍植物學性狀比較

無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍自交系的植株性狀見圖3。紫.中花芥藍植株葉表面光亮，有光澤，無蠟質，葉片、葉脈、菜薹均表現為紫色，葉片薄而質地脆嫩；野生型芥藍葉片灰綠色，有蠟質，葉脈、菜薹均表現為紫色。而紫.中花芥藍×普通多蠟質綠色芥藍的F1表現為葉片紫色、葉面有蠟質。說明，芥藍葉片無蠟質性狀對多蠟質為隱性遺傳、紫色性狀對綠色為顯性遺傳。

圖3 無蠟質突變型紫.中花芥藍與多蠟質野生型芥藍自交系植株

2.2 葉片超微結構觀察

2.2.1 葉片腹面蠟質的比較 多蠟質野生型芥藍的新葉、初生葉、次生葉和老葉無蠟質突變型腹面的蠟質均明顯多于無蠟質突變型紫.中花芥藍。新葉時，野生型芥藍葉片腹面的蠟質為不規則顆粒和針狀，紫.中花芥藍為不規則顆粒（圖4）；初生葉時，野生型芥藍葉片腹面的蠟質為圓柱狀、片狀晶體，具有規則的三維結構，紫.中花芥藍為不規則顆粒和針狀，聚集成團（圖5）；次生葉時，野生型芥藍葉片腹面的蠟質為片狀晶體，具有規則的三維結構，紫.中花芥藍為不規則顆粒和針狀，聚集成團，個體增大（圖6）；老葉時，野生型芥藍葉片腹面的蠟質為顆粒狀，聚集成團，形狀不規則，紫.中花芥藍為瘤狀突起（圖7），此時野生型芥藍和紫.中花芥藍葉片腹面的蠟質均退化，這與葉片衰老、功能喪失有關。由此可見，隨著葉片的發育，野生型芥藍和紫.中花芥藍葉片腹面的蠟質逐漸增多、三維結構增強；至老葉時，因葉片老化，蠟質隨之退化。

圖4 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍新葉腹面超微結構

圖5 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍初生葉腹面超微結構

圖6 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍次生葉腹面超微結構

圖7 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍老葉腹面超微結構

2.2.2 葉片背面蠟質的比較 多蠟質野生型芥藍的新葉、初生葉、次生葉和老葉無蠟質突變型背面的蠟質均明顯多于無蠟質突變型紫.中花芥藍。新葉時，野生型芥藍葉片背面的蠟質為管狀、針狀晶體，紫.中花芥藍為片狀、針狀晶體，個體大，三維結構明顯（圖8）；初生葉時，野生型芥藍葉片背面的蠟質為片狀、針狀，三維結構增強，紫.中花芥藍為片狀、針狀（圖9）；次生葉時，野生型芥藍葉片背面的蠟質為片狀、針狀，三維結構進一步增強，紫.中花芥藍為片狀，聚集成團，開始退化（圖10）；老葉時，野生型芥藍葉片背面的蠟質為密集的片狀、針狀，三維結構最強，紫.中花芥藍為瘤狀，退化嚴重。由此可見，隨著葉片的發育，野生型芥藍和紫.中花芥藍葉片背面的蠟質逐漸增多，但紫.中花芥藍的蠟質退化速度比野生型芥藍更快。

2.2.3 葉片腹面、背面蠟質的比較 由圖4～11可見，野生型芥藍和紫.中花芥藍葉片背面的蠟質多于腹面，背面蠟質退化的速度慢于腹面。野生型芥藍葉片背面與腹面相比，背面蠟質退化速度極顯著地慢于腹面，4個時期葉片背面的蠟質一直在增多、發育，在老葉時發育最好，而腹面的蠟質在老葉時開始退化；紫.中花芥藍葉片背面與腹面相比，新葉背面的蠟質發育最好，隨后開始退化，而腹面的蠟質在4個時期發育都比較差，老葉時完全退化。

圖8 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍新葉背面超微結構

圖9 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍初生葉背面超微結構

圖10 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍次生葉背面超微結構

圖11 無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍老葉背面超微結構

2.3 營養品質

由表1可見，無蠟質突變型紫.中花芥藍和多蠟質野生型芥藍的VC、花青苷含量均高于對照普通綠色芥藍（CK），而紫.中花芥藍和野生型芥藍的花青苷含量相近；紫.中花芥藍的VC含量、干物質量高于野生型芥藍，可滴定酸、可溶性糖、粗纖維（DW）含量低于野生型芥藍。由此可見，亮葉無蠟質突變型紫.中花芥藍不僅增加了VC含量，而且降低了粗纖維（DW）含量；與對照相比，尤其是增加了花青苷含量。

表1 3種芥藍主要營養品質

3 結論與討論

3.1 野生型芥藍的葉面蠟質多于無蠟質突變型紫.中花芥藍

紫.中花芥藍的葉片不僅具有蠟質結構，而且背面的蠟質尤為明顯，因此紫.中花芥藍葉片無蠟質是相對的。多蠟質紫色芥藍野生型的新葉、初生葉、次生葉和老葉腹面、背面的蠟質均明顯多于紫.中花芥藍4個時期的葉面蠟質。位于葉片背面的蠟質，無論是多蠟質野生型芥藍還是紫.中花芥藍均多于腹面，這一結果與周小云（2006）、曾愛松等（2009）和牟香麗等（2013）報道的甘藍葉片腹面的蠟質多于背面的結論不同，這可能與試驗的材料及取材部位有關。芥藍不包球，以幼嫩、肉質的花薹和嫩葉為主要食用器官（除老葉外，均可食用），且芥藍葉片與莖形成的角度接近45°；而甘藍包球，以葉球為食用器官（球葉以外的葉片，一般不可食用）。牟香麗等（2013）是在甘藍的結球期和成熟期選取最內層外葉為試材，此時甘藍的葉片為彎曲、抱合的球葉，不同于接近45°的芥藍葉片。今后，應將亮葉無蠟質甘藍、無蠟質亮葉芥藍（初蓮香 等，1998）和紫.中花芥藍種植在同一條件下，再進一步比較三者葉片腹面、背面蠟質的異同。

3.2 紫.中花芥藍有利于提高芥藍品質

紫.中花芥藍不僅提高了VC含量、降低了粗纖維（DW）含量，而且與普通綠色芥藍相比，含有花青苷成分等優點更為突出，因此亮葉無蠟質紫色芥藍突變型紫.中花芥藍有利于改良現有芥藍的營養品質。由于花青苷具有水溶性，VC遇高溫容易降解等特點，建議育成的高營養品質紫色芥藍新品種以生食為主，如涼拌、配菜等。

3.3 有關紫.中花芥藍的選育工作

筆者已經獲得了紫.中花芥藍×普通多蠟質綠色芥藍的6個世代種子。2015年秋季將在露地種植這6個世代，調查每個群體各單株紫色和蠟質的有無等分離情況，進一步開展蠟質、紫色等遺傳規律研究；同時，利用紫.中花芥藍×普通多蠟質綠色芥藍配制的BC1回交群體，采用分離群體分組分析法（bulked segregant analysis，BSA），開展與紫色、蠟質相關基因的初步定位研究，并建立分子輔助育種技術體系，在苗期能夠區分純合、雜合蠟質和紫色基因型，為快速育成亮葉無蠟質且葉片、葉脈和菜薹均為紫色的芥藍一代雜種提供依據。

初蓮香，王秋艷，王英明，王永昌．1998．無蠟粉亮葉芥藍的選育及利用．中國蔬菜，（4）：30-31．

牟香麗，王超，王帥．2013．甘藍無蠟粉突變體葉表皮蠟質超微結構觀察．中國蔬菜，（4）：32-37．

曾愛松，劉玉梅，方智遠．2009．甘藍耐裂球性與葉表面微形態及細胞組織結構的關系研究．華北農學報，（2）：41-45．

周小云．2006．水稻葉表皮蠟質發育及蠟質相關轉錄因子基因OsWTF1和OsWTF2的克隆與鑒定〔博士論文〕．長沙：湖南農業大學．

Bernard A，Joub è s J．2013．Arabidopsis cuticular waxes：advances in synthesis，export and regulation．Prog Lipid Res，52（1）：110-129．

Lin J，Dickson M H，Eckenrode C J．1984．Resistance of Brassica lines to the diamondback moth（Lepidoptera：Yponomeutidae）in the field and inheritance resistance．Journal of Economic Ent omology，77：1293-1296．

Stoner K A．1990．Glossy leaf wax and plant resistance to insects in Brassica oleracea under natural infestation．Environmental Entomology，19（3）：730-739．

Zhang Y，Kensler T W，Cho C G，Posner G H，Talalay P．1994．Anticarcinogenic activities of sulforaphane and structurally related synthetic norbornyl isothiocyanates．Proc Natl Acad Sci，91（8）：3147-3150．

Ultra-microstructure of Epicuticular Wax on Waxless Mutant of Chinese Kale（Brassica alboglabra L. H. Bailey）

ZHANG De-shuang1，SUN Lei1，2，ZHANG Feng-lan1，HE Hong-ju1，YU Shuan-cang1，YU Yang-jun1，ZHAO Xiu-yun1，ZHAO Xue-zhi1，WANG Wei-hong1，SU Tong-bing1，LU Gui-xiang1
（1Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097，China；2Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China）

Epicuticular waxes of leaves at 4 developing stages in Chinese kale（Brassica alboglabra L. H. Bailey）waxless mutant named‘Zi.zhonghuajielan’and wild type（WT）were observed by scanning electron microscope（SEM）．Meanwhile，crude weight，VC，soluble sugar，crude fiber，protein and anthocyanins were measured. The results showed that epicuticular waxes at 4 growth periods of wild type were apparently higher than those of mutant. Epicuticular waxes at leaf abaxial of mutant and WT were higher than those of leaf adaxial．Epicuticular waxes at leaf abaxial of WT degenerated slowly than those of leaf adaxial. VC in waxless mutant was higher than that of WT，and dry weight of crude weight in waxless mutant was lower than that of WT．Thus，waxless mutant in Chinese kale can supply higher nutrition of VC and anthocyanins．Gene controlled wax biosynthesis in Chinese kale waxless mutant was recessive，while gene or genes controlled anthocyanins biosynthesis were dominant，compared to WT．Furthermore brilliant green，waxless and purple Chinese kale uncooked is more suitable for eating．

Chinese kale（Brassica alboglabra L. H. Bailey）；Waxless mutant；Ultra-microstructure；Anthocyanins

張德雙，男，博士，研究員，專業方向：蔬菜遺傳育種及分子生物學，E-mail：zhangdeshuang@nercv.org

2015-07-14；接受日期：2015-10-08

北京市農林科學院科技創新能力建設專項（KJCX20140111-3），大宗蔬菜產業技術體系專項（CARS-25-A-11），北京市葉類蔬菜創新團隊資助項目（blvt-01）