S1P通路在膽鹽所致HL-7702細(xì)胞毒性損傷中的作用*

梁君銘曾 寬鄒堂斌

S1P通路在膽鹽所致HL-7702細(xì)胞毒性損傷中的作用*

梁君銘①曾 寬②鄒堂斌③

目的：探討S1P通路在膽鹽所致HL-7702細(xì)胞毒性損傷中的作用。方法：應(yīng)用甘氨鵝脫氧膽酸鹽（GCDC）處理HL-7702細(xì)胞建立膽鹽損傷肝細(xì)胞模型，應(yīng)用CCK-8試劑盒-8檢測細(xì)胞存活率，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液S1P的表達(dá)，Western blot法測定caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：應(yīng)用150 μmol/L GCDC處理HL-7702細(xì)胞24 h可引起毒性損傷，10 μmol/L VPC23019（S1PR1抑制劑）預(yù)處理30 min可對抗GCDC引起的損傷，使細(xì)胞存活率升高，凋亡細(xì)胞數(shù)目和cleaved caspase-3表達(dá)均減少。結(jié)論：GCDC可以引起HL-7702細(xì)胞毒性，S1P通路介導(dǎo)GCDC對HL-7702細(xì)胞的損傷作用。

甘氨鵝脫氧膽酸鹽； 凋亡； S1P； SphK1激酶； HL-7702細(xì)胞

膽汁淤積性黃疸病因復(fù)雜，能引起肝臟等損害，膽汁淤積膽酸鹽所致肝實質(zhì)細(xì)胞毒性損傷是膽汁淤積性黃疸肝損害的重要機(jī)制[1-3]。其中甘氨鵝脫氧膽酸鹽（Glycochenodeoxcholate，GCDC）是引起肝細(xì)胞損傷的主要膽汁酸，在膽汁淤積性黃疸時濃度升高最為明顯[4]。新近研究表明，鞘磷脂在肝臟生理和病理中有重要作用，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是鞘磷脂的重要代謝產(chǎn)物，而鞘氨醇激酶（Sphingosine kinase，SphK）是調(diào)控鞘脂代謝平衡的關(guān)鍵酶，S1P信號通路可能參與肝癌、膽汁淤積所致肝實質(zhì)細(xì)胞損傷，但是S1P信號通路與膽汁淤積膽酸鹽引起肝臟實質(zhì)細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不明確[1-3]。因此，本研究在HL-7702細(xì)胞建立膽酸鹽損傷細(xì)胞模型，探討S1P信號通路在GCDC損傷HL-7702細(xì)胞中的作用及其有關(guān)機(jī)制[2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 GCDC和VPC23019購自美國Sigma-Aldrich公司，CCK-試劑盒-8購自日本Dojindo公司，DMEM-F12培養(yǎng)基以及特級胎牛血清FBS購自美國Gibco BRL公司，Cleaved-caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，S1P ELISA測定試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司，人HL-7702肝細(xì)胞株購自深圳市百恩維生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法測定HL-7702細(xì)胞存活率 當(dāng)HL-7702細(xì)胞生長融合度至70％～80％時，給予含GCDC或VPC23019的培養(yǎng)基干預(yù)24 h或30 min后，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書檢測細(xì)胞存活率。每孔加入10％無血清培養(yǎng)基稀釋的CCK-8工作液100 μL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h，用Multiskan MK3酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度。取4孔光密度OD平均值，按照說明書公式計算細(xì)胞存活率，重復(fù)實驗3次后收集數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析。

1.2.2 Western blot法檢測caspase-3蛋白的表達(dá) 接種于60 mm培養(yǎng)皿的HL-7702細(xì)胞5×106，給予含GCDC或VPC23019的培養(yǎng)基干預(yù)24 h或30 min后，用冷PBS洗兩次，加入適量細(xì)胞裂解液，4 ℃靜置30 min，使用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，置入2 mL離心管中，12 000 rpm離心10 min，取上清約2 μL采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，剩余上清液保存于低溫冰箱以備電泳。總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉60 min，然后在兔抗人caspase-3抗體（美國Bioworld Technology公司）孵育液中4 ℃過夜，接著與相應(yīng)的二抗室溫孵育90 min。用ECL發(fā)光液顯色后，暗室曝光到X線片，掃描后用ImageJ 1.410軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 雙抗體夾心ELISA方法檢測上清液S1P的表達(dá) 接種于96孔板的HL-7702細(xì)胞，給予含GCDC或VPC23019的培養(yǎng)基干預(yù)24 h或30 min后，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加到S1P抗體預(yù)先包被的酶標(biāo)板中，37 ℃培養(yǎng)箱孵育90 min，然后吸去上清液，接著加入S1P抗體繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，TBS漂洗3次后，加入生物素標(biāo)記的二抗37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，加入TMB顯色，終止液終止反應(yīng)后，用Multiskan MK3酶標(biāo)儀（入=450 nm）記錄吸光度。取3孔吸光度的平均數(shù)，按公式計算上清液S1P的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)（mean±SE）表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較按照最小顯著性差異進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P通路介導(dǎo)GCDC引起的HL-7702細(xì)胞毒性 根據(jù)筆者前期的實驗研究，應(yīng)用150 mol/L GCDC處理HL-7702細(xì)胞24 h建立膽酸鹽損傷肝細(xì)胞模型，CCK-8試劑盒測定細(xì)胞存活率。未經(jīng)任何處理的對照組細(xì)胞存活率為100％，150 μmol/L GCDC組處理HL-7702細(xì)胞24 h可明顯地產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率為（60.8±5.2 630）％明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；1.25 μmol/L及2.5 μmol/L濃度的VPC23019（S1PR1抑制劑）未能抑制GCDC引起的HL-7702細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞存活率分別為（61.6±4.0 373）％、（62.8±4.3 243）％，與GCDC組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)的VPC23019（S1PR1抑制劑）能抑制GCDC引起的HL-7702細(xì)胞毒性作用，其中10 μmol/L VPC23019+GCDC預(yù)處理30 min的抑制作用最顯著，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高分別為（70.2±2.5 884）％、（80.4±2.7 018）％、（70±2.9 154）％，與GCDC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。單獨10 μmol/L VPC23019預(yù)處理對細(xì)胞存活率無明顯影響。

圖1 S1P通路介導(dǎo)GCDC引起的HL-7702細(xì)胞毒性*P＜0.05，**P＜0.01，與GCDC組比較；##P＜0.01，與對照組比較

2.2 S1P通路介導(dǎo)GCDC引起的HL-7702細(xì)胞凋亡 免疫印跡法測定cleaved caspase-3表達(dá)（是反映細(xì)胞凋亡的一個指標(biāo)），未經(jīng)任何處理的對照組cleaved caspase-3/β-actin比值為（0.5±0.0 894），150 μmol/L GCDC處理組HL-7702細(xì)胞24 h比值為（1.2±0.1 788）可明顯地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但是，在GCDC作用HL-7702細(xì)胞前，10 μmol/L VPC23019預(yù)處理30 min能抑制GCDC對cleaved caspase-3表達(dá)的上調(diào)作用其比值為（0.8±0.0 894），可抑制GCDC的促凋亡作用，與GCDC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。10 μmol/L VPC23019單獨處理HL-7702細(xì)胞24 h對細(xì)胞凋亡無明顯的影響，其比值為（0.53±0.0 806），與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 S1P通路介導(dǎo)GCDC所致HL-7702細(xì)胞凋亡**與對照組比較，P＜0.01，##與GCDC組比較，P＜0.01

2.3 SphK1抑制劑阻抑GCDC對HL-7702細(xì)胞S1P表達(dá)的上調(diào)作用 ELISA測定培養(yǎng)上清液中S1P的含量，未經(jīng)任何處理的對照組培養(yǎng)上清液S1P濃度為（119.6±9.3 950）pmol/mL，150 μmol/L GCDC組處理HL-7702細(xì)胞24 h可使S1P表達(dá)明顯增多為（160.3±8.9 442）pmol/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；但是，在GCDC作用HL-7702細(xì)胞前，應(yīng)用10 μmol/L VPC23019預(yù)處理30 min可明顯地拮抗GCDC對S1P表達(dá)的上調(diào)作用，上清液S1P濃度為（140.8±7.0 894）S1P，與GCDC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示SphK1通路參與了GCDC對S1P表達(dá)的上調(diào)作用。單獨10 μmol/L VPC23019預(yù)處理對培養(yǎng)上清液S1P濃度無影響為（121.53±9.0 774）pmol/mL，見圖3。

3 討論

磷脂是細(xì)胞膜的重要組分，主要包含有兩大類磷脂，即由甘油構(gòu)成的甘油磷脂（phosphoglyceride），由神經(jīng)鞘氨醇構(gòu)成的鞘磷脂（sphingolipid）。鞘磷脂（sphingomyelin）是含硝氨醇或二氫鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺鍵與鞘氨醇的氨基相連。人體含量最多的鞘磷脂是神經(jīng)鞘磷脂，由鞘氨醇、脂肪酸及磷酸膽堿構(gòu)成，常與卵磷脂存在于細(xì)胞膜外側(cè)。鞘磷脂的代謝產(chǎn)物為神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）等。1-磷酸鞘氨醇（S1P）是重要的磷脂代謝產(chǎn)物，參與細(xì)胞增殖、存活和遷移等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。S1P在細(xì)胞內(nèi)由鞘氨醇激酶（SphK）使鞘氨醇磷酸化而形成。S1P代謝的異常調(diào)節(jié)已經(jīng)成為多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。靶向SphK-S1P信號通路的抑制劑、激動劑及抗體等已經(jīng)成為眾多腫瘤的新治療策略。越來越多的證據(jù)表明，鞘磷脂參與調(diào)控細(xì)胞的生長、周期和凋亡等，鞘磷脂的重要活性代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P），鞘氨醇激酶（sphingosine kinase1，SphK1）是鞘氨醇生成S1P的關(guān)鍵限速酶，SphK1/ S1P信號通路在肝細(xì)胞存活或凋亡中有重要作用[4-6]。近來有研究表明，膽汁淤積性黃疸引起肝實質(zhì)細(xì)胞損傷是急慢性肝病的病因之一，其中不同濃度的膽汁酸對肝實質(zhì)細(xì)胞的損害程度相同，膽汁酸低濃度時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高濃度的膽汁酸則可導(dǎo)致細(xì)胞壞死[7-9]。細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝平衡對于維持細(xì)胞增殖、分化和凋亡發(fā)揮重要作用，鞘脂代謝物包括神經(jīng)酰胺、神經(jīng)鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸鹽等，可作為重要的信號分子，在肝細(xì)胞損傷和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[10-17]。

圖3 S1P通路介導(dǎo)GCDC所致HL-7702細(xì)胞S1P的生成**與對照組比較，P＜0.01；##與GCDC組比較，P＜0.01

本研究結(jié)果顯示，膽汁酸中的甘氨鵝脫氧膽酸鹽（GCDC）能引起人HL-7702細(xì)胞明顯的毒性損傷，其表現(xiàn)為GCDC劑量依賴性地導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降，及細(xì)胞凋亡增加，其中150 μmol/L GCDC處理HL-7702細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率下降顯著，這與先前研究結(jié)果相吻合[5-8]。引人注意的是，本研究也發(fā)現(xiàn)，在GCDC處理HL-7702細(xì)胞前，10 μmol/L VPC23019能抑制GCDC所致肝細(xì)胞毒性損傷和促凋亡作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高，以及細(xì)胞凋亡減少。以上研究結(jié)果提示，S1P/S1PR1信號通路可能介導(dǎo)了膽汁酸（GCDC）對肝實質(zhì)細(xì)胞（如HL-7702細(xì)胞）的毒性損傷，而膽汁酸（GCDC）對肝實質(zhì)細(xì)胞的毒性損傷是否通過受體下游MAPK、STAT3等信號通路呢？這期待將來進(jìn)一步深入研究探索。

綜上所述，本研究首次證實S1P/S1PR1通路可介導(dǎo)了膽汁酸（GCDC）對肝實質(zhì)細(xì)胞（如HL-7702細(xì)胞）引起的細(xì)胞毒性及致凋亡作用，本文為臨床防治膽汁淤積性肝臟損傷提供了新的實驗依據(jù)。

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Role of S1P Pathway in Bile Salt-induced Injury in HL-7702 Cells

LIANG Jun-ming，ZENG Kuan，ZOU Tangbin.//Medical Innovation of China，2015，12（20）：015-017

Objective： To explore the role of S1P pathway in the bile salt-induced injury in HL-7702 cells.Method：HL-7702 cells were treated with glycochenodeoxycholate （GCDC） to establish a bile salt-induced cellular injury model，cell viability was detected by CCK-8 kit. The expression of S1P in the cell culture supernatant was detected by ELISA，and the expression level of caspase-3 protein was determined by Western blot assay.Result：Exposure of HL-7702 cells to 150 μmol/L GCDC for 24 h markedly enhanced cell apoptosis.Pretreatment of HL-7702 cells with 10 μmol/L VPC23019（a S1PR1 inhibitor） for 30 min before exposure to GCDC inhibited the cytotoxicity induced by GCDC， it made cell viability increase，the number of apoptotic cells and expression of cleaved caspase-3 decrease. Conclusion：GCDC can induced cytotoxicity in HL-7702 cells，S1P pathway mediates the GCDC-induced injury in HL-7702 cells.

Glycochenodeoxcholate； Apoptosis； S1P； SphK1 kinase； HL-7702 cells

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.20.005

2015-03-17） （本文編輯：周亞杰）

廣東省科技計劃項目（2013B031800016）；東莞市科技計劃項目（2014108101053）

①廣東省佛山市順徳區(qū)第一人民醫(yī)院附屬杏壇醫(yī)院 廣東 佛山528325

②中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院

③廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院

鄒堂斌

First-author’s address：The First People’s Hospital of Shunde Affiliated Xingtan Hospital，F(xiàn)oshan 528325，China