異甘草素對創傷性腦損傷大鼠神經保護作用的實驗研究

姜拓之，楊永明，荔志云

·論 著·

異甘草素對創傷性腦損傷大鼠神經保護作用的實驗研究

姜拓之，楊永明，荔志云

目的觀察異甘草素(ISL)對創傷性腦損傷大鼠腦組織超岐過氧化物酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腦含水量的影響，初步觀察在創傷性腦損傷(TBI中)的作用，探討其在TBI后促進腦組織康復的作用機制。方法參照Feeney法建立大鼠腦損傷模型，將動物隨機分為假手術組、腦損傷組、ISL治療組。術后2h ISL治療組給予ISL 20mg/kg藥物灌胃治療1次/d，模型組和假手術組等量的生理灌胃治療1次/d，7d后處死。采用終點法測定SOD和MDA,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腦組織、IL-6和TNF-α含量，干濕重法測量腦組織含水量，HE染色光鏡下觀察腦皮層及損傷灶組織形態變化。結果與腦損傷組相比，ISL治療后SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA、IL-6、TNF-α及腦組織含水量明顯減低(P<0.05)，損傷側腦皮層及損傷灶組織病理學明顯改善。結論ISL可促進TBI大鼠的腦組織具有神經保護作用，其機制可能與降低氧化應激和調節腦組織細胞因子有關。

顱腦損傷； 神經； 異甘草素； 大鼠

近年來由交通事故和地震等自然災害引起的創傷性腦損傷(traumatic brain injury， TBI)呈上升趨勢，其死亡率和致殘率高，給患者及家庭造成極大的痛苦，也給社會帶來沉重的負擔。腦創傷后，損傷灶部位腦組織產生大量的自由基和炎癥介質引起神經元水腫和壞死是導致繼發性腦損傷的一個重要原因，中藥干草的提取物異甘草素(isoliquiritigenin， ISL)具有較為廣泛的藥理活性，其在神經損傷修復方面有多種作用[1]，本實驗通過ISL對TBI大鼠進行干預，探討其治療機制。

材料與方法

1實驗動物、試劑及儀器

SPF級Wistar 雄性大鼠45只，由蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科提供，鼠齡2～3個月，體重150～200g，異甘草素(純度98%)由上海源葉生物科技公司提供,超岐過氧化物酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒由南京建成試劑公司提供，白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒由上海豐翔生物科技有限公司提供。超低溫冰箱由日本三洋公司提供，低速離心機由北京醫用離心機公司提供，直接讀數分析天平由日本島津公司提供，全自動酶標儀由中國南京華東電子廠提供，分光光度計由上海天美科學儀器廠提供，恒溫水浴箱由上海喬楓實業公司提供。顯微鏡由日本OLYMPUS公司提供。

2腦損傷模型制作

大鼠用10%水合氯醛(30mg/kg，腹腔注射)麻醉后，參照Feeney法[2]，制作TBI自由落體打擊模型(打擊直徑3mm、深度3mm，打擊棒重30g、打擊高度30cm、沖擊力900g.cm)造成左側大腦半球局部腦挫裂傷，假手術組僅開骨窗不打擊。大鼠出現短暫的四肢抽搐，呼吸暫停為造模成功。

3動物分組及給藥

隨機分為A組(假手術組)、B組(模型組)、C組(ISL治療組)，每組15只。術后2h C組給予ISL1%吐溫80生理鹽水20mg/kg腹腔注射治療1次/d，模型組和假手術組等量的1%吐溫80生理鹽水腹腔注射治療1次/d，共治療5d。

4雙側前爪肌抓力實驗

實驗動物于TBI后第5d，各組任取10只大鼠做雙側前爪肌抓力實驗，測定前爪肌力，按評雙側前爪肌抓力實驗評分標準評分，雙側前爪肌抓力實驗評分越高肌力越好，評分完畢后將所有大鼠放回原組。

輕抓取大鼠頸背部皮膚，提起大鼠并使前爪輕觸直徑0.15mm，長46cm，置于距地面70cm高度上鐵絲繩(其下放高3.5cm泡沫箱)。將大鼠2個前爪放在繩上，放開，記錄大鼠在繩上的時間。評分標準： 0分： 掛在繩上0～2s； 1分： 掛在繩上3～4s； 2分： 掛在繩上5s； 3分： 掛在繩上5s，將后肢置于繩上。

5干濕比重法腦組織含水量檢測

實驗動物于TBI后第5d，各組任取5只大鼠，每只經10%水合氯醛2ml腹腔注射麻醉后斷頭處死，取大鼠損傷側腦組織體積約0.5ml，去除凝血，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，用電子天平測其濕重，然后于60℃通風烘烤箱烘烤96h，取出稱干重，計算含水量： 腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

6腦組織SOD及MDA含量、TNF-α和IL-6的檢測

實驗動物于TBI后第5d，各組隨機取5只大鼠，每只經10%水合氯醛2ml腹腔注射過量麻醉后迅速斷頭取腦， 用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，取受打擊部位腦組織約0.2ml用電子天平測其重量后加入9倍體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)制作損傷大腦皮層勻漿， 離心后提取上清液按照說明書步驟進行腦組織勻漿液SOD及MDA、IL-6和TNF-α檢測。

7病理切片觀察腦皮層及損傷灶組織形態變化

實驗動物于TBI后第5d，各組隨機取5只大鼠，每只經10%水合氯醛2ml腹腔注射過量麻醉后切開胸腔，經左心室用生理鹽水沖至上腔靜脈流出液體清亮后再用4%的多聚甲醛沖洗3次，內固定后取腦用冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，浸入4%多聚甲醛固定48h，石蠟包埋，以損傷灶中心制作腦組織矢狀位切片,片厚3um，HE染色顯微鏡放大50倍觀察腦皮層及損傷灶組織形態學病理變化。

8統計學處理

結 果

1雙側前爪肌抓力實驗評分結果

實驗動物于TBI后第5d，A組(3.00±0.51)分； B組(0.52±0.21)分； C組(2.37±0.47)分。B組評分顯著低于A組(P<0.01)，與B組比較C組評分明顯增高(P<0.01)。

2腦組織含水量、SOD、MDA、IL-6、TNF-α檢測結果

實驗動物TBI后第5d，B組大鼠腦組織含水量、MDA、IL-6和TNF-α均顯著高于A組(P<0.01)，SOD 活性均顯著低于A組(P<0.01)； C組腦組織含水量、MDA、IL-6和TNF-α均低于B組(P<0.05)； C組腦組織SOD高于B組(P<0.05)(表1)。

3腦皮層組織形態學觀察

A組腦皮層細胞均勻分布，細胞密集，軟腦膜連續且完整； B組腦皮層打擊灶形成以腦軟化灶，創面凹陷，細胞數目明顯稀疏，半透明水腫帶超出損傷灶延伸至海馬，軟腦膜膜缺損； C組腦皮層損傷灶細胞數明顯增多，傷口已被肉芽組織填平，軟腦膜已經形成，并與正常腦組織入腦膜相續，半透明水腫帶較B組窄，水腫帶主要局限在損傷灶底部，見圖1。

表1 ISL對腦損傷大鼠腦組織含水量和細胞因子及氧化應激指標的影響

與A組比較：*P<0.01； 與B組比較：△P<0.05

A組(假手術組)×50 B組(模型組)×50 C組(ISL治療組)×50

圖1 腦皮層組織形態學病理切片觀察

討 論

腦損傷后氧化應激是加重繼發性腦損傷的重要機制，腦組織損傷后活性氧如超氧陰離子自由基(O2-)、過氧亞硝基陰離子、羥基自由基可導致組織破壞和細胞死亡。氧化應激可以使細胞直接死亡，還可誘導凋亡程序啟動，加重腦損傷。Smith等[3]報道TBI、創傷性脊髓損傷和缺血性腦損傷均可引起氧化應激反應，產生脂質過氧化、蛋白質氧化等，并可以損傷DNA，導致神經細胞死亡。SOD超氧化物歧化酶能催化超氧化物歧化成氧和過氧化氫，MDA是脂質氧化產物，兩者成負相關，聯合檢測可以準確反應組織氧化應激反應水平，可以衡量藥物抗氧化應激的有效性[4]。腦水腫是創傷性顱腦損傷一個重要的病理機制，是顱內壓增高的主要原因[5]。TBI后，血管壁破壞，血液進入組織間隙，引起血管性腦水腫，損傷區血供減少，細胞缺血引起細胞鈉鉀泵轉運障礙，細胞內鈉離子聚集導致細胞水腫，顱內特殊結構系統的損傷可引起腦脊液回流障礙導致腦積水，以上因素均可使顱內壓升高，對生命造成巨大威脅。TBI后小膠質細胞和星形膠質細胞的激活早期TNF-α等細胞炎癥因子便有升高[6]。Herz等[7]報道IL-6和TNF-α水平增高可引起炎性細胞聚集，血管通透性增高，加重腦組織損傷。Laird等[8]研究顯示小膠質細胞過多表達IL-6可促進星形膠質細胞水通道蛋白4(AQP4)表達，加重腦水腫。

中藥甘草的提取物ISL具有多中藥理活性，楊永明和荔志云[9]報道ISL可以通過調節細胞因子促進TBI大鼠康復。本實驗發現TBI大鼠經異甘草素治療5d后，ISL治療組腦水腫較模型組明顯減輕。腦皮層病理切片放大50倍觀察ISL治療組損傷灶周圍水腫帶明顯小于模型組，損傷灶肉芽組織增生明顯多于模型組。ISL治療組損傷灶已經被肉芽組織完全充填，軟腦膜已經形成并且大鼠前爪肌力改善。實驗中可見ISL治療組SOD活性明顯高于模型組，ISL治療組腦組織MDA含量、IL-6和TNF-α含量、腦組織含水量低于模型組，ISL治療組病理組織形態學觀察好于模型組。且腦組織含水量降低與水腫帶縮小相吻合，腦組織病理學結果與神經行為學觀察相吻合。實驗提示ISL通過上調腦組織SOD的活性、減少MDA的生成、降低IL-6和TNF-α的含量，保護TBI大鼠神經組織，其在腦組織其他方面的作用值得進一步研究。

[1] 付亞杰，荔志云.甘草各有效成分對神經保護作用的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2012,39(3)：298-300.

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[9] 楊永明,荔志云.異甘草素對創傷性腦損傷大鼠損傷灶修復作用的實驗研究[J].創傷外科雜志,2014,16(2):144-146.

Experimentalstudyofisoliquiritigeninneuroprotectionontraumaticbraininjuryinrats

JIANGTuo-zhi，YANGYong-ming,LIZhi-yun

(Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command,Lanzhou 730050,China)

ObjectiveTo observe the effect of isoliquiritigenin(ISL)on pathological changes and SOD,MDA,IL-6,TNF-α and water content of brain tissue after traumatic brain injury in rats and to investigate its possible mechanism for brain rehabilitation.MethodsRats were randomly divided into 3 groups: sham group,TBI group and ISL group. TBI model was established with the modified Feeney’s method. The ISL group

intragastricly ISL 20mg/kg 1 times/d,the TBI group and sham group received the same amount of physiological gavage 2 hours after surgery. After 7 days rats were sacrificed to measure the SOD,MDA of brain tissue using endpoint method,and ELISA was employed to detect the content of IL-6 and TNF-α,wet-dry weighting method was employed to measure water content in the brain tissue. The pathology of the brain tissues was observed under optical microscope through HE staining.ResultsCompared with TBI group,the content of MDA was decreased,the content of SOD,IL-6 and TNF-α was increased,and the pathology of the brain tissues was improved.ConclusionISL can promote brain tissue rehabilitation of traumatic brain injury in rats. The underlying mechanism may be associated with reduction of oxidative stress and regulation of cytokines of brain tissue.

brain injury; nerves; isoliquiritigenin rats

1009-4237(2015)02-0113-04

R 651.1

A

2012中國人民解放軍后勤科研項目(CLZ12J006)

730050 甘肅,蘭州軍區蘭州總醫院神經外科

荔志云,E-mail：Lizhiyun456@163.com

2014-06-05；

2014-07-14)

(本文編輯： 郭 衛)

·臨床問答·

問題3： 創傷性顱腦損傷致腦疝發生包括哪些部位以及不同部位涉及的大腦結構和相應的臨床表現如何？

解答：

腦疝發生部位涉及的組織結構相應的臨床表現大腦鐮疝扣帶回，胼周動脈下肢乏力海馬鉤回疝動眼神經，大腦腳，大腦后動脈上瞼下垂，同側瞳孔散大，對側偏癱；可有意識障礙頂蓋疝上丘雙側上瞼下垂，上視不能軸位疝基底動脈穿支，中腦腦橋延髓，意識下降、眼球運動障礙、呼吸不規律、呼吸驟停、高血壓、心動過緩網狀結構小腦扁桃體疝延髓呼吸困難或驟停

(雷 鵬，賀教江 蘭州軍區蘭州總醫院神經外科，甘肅 蘭州 730050)