TDZ對杏香兔耳風組培苗復壯的影響

李峰卿，姚甲寶，曾滿生，厲月橋，袁雅琪，周新華

（中國林業科學研究院 亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600）

TDZ對杏香兔耳風組培苗復壯的影響

李峰卿，姚甲寶，曾滿生，厲月橋，袁雅琪，周新華

（中國林業科學研究院 亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600）

為了了解TDZ對組培苗增殖的影響情況，探討了TDZ在衰退組培苗復壯過程中的作用，以增殖衰退的杏香兔耳風組培苗為試驗材料，就TDZ的不同添加方式（抽濾滅菌和高壓滅菌）和不同濃度（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L）處理對組培苗增殖系數、有效芽及苗高生長的影響情況進行了試驗。結果表明：當TDZ的濃度＞0.2 mg/L時，TDZ的添加方式對組培苗的增殖系數和有效芽數均有較大影響，抽濾滅菌后的增殖系數和有效芽數要明顯高于高壓滅菌的；不同濃度的TDZ對有效芽數和髙生長的影響均有極顯著的差異性（P＜0.01），當TDZ濃度為0.8 mg/L時，苗質量總體達到最優，增殖系數為5.11，達到了預期的復壯效果；最優生根培養基配方為1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋IBA 0.1 mg/L。在杏香兔耳風組培苗復壯過程中，TDZ可作為一種有效的植物生長調節劑使用。

杏香兔耳風；TDZ；組織培養；增殖；復壯

苯基噻二唑基脲（Thidazuron，TDZ）是西德Schering公司早于1976年就宣布合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物[1]，Mok在對棉豆的研究中首次發現其有很強的細胞分裂素活性[2]，其活性超過了玉米素。近年來，在許多植物的組織培養中，它能誘導離體材料多種途徑形態發生，具有生長素和細胞分裂素的雙重作用[3]，常用作形態發生的調節劑。

杏香兔耳風Ainsliaea fragransChamp為菊科兔耳風屬植物，有白走馬胎、金邊兔耳草、一枝香等別名[4]，是江西特有的重要林下藥用植物，全草可入藥，具有清熱補虛、涼血止血、利濕解毒之功效，其藥用價值很高。然而，隨著其藥用價值研究的廣泛和深入，市場用藥量急劇增加，而該植物不僅整株被采集，且采集時間又在開花結實之前，致使野生杏香兔耳風資源無法完成世代更替，天然資源日漸枯竭。近幾年，江香梅等人分別以不同的材料作為外植體進行了組織培養和快速繁殖的研究[5-7]，但普遍存在組培苗增殖倍數低、生根率低及移栽成活率低等問題，尚未形成較成熟的快繁技術體系，難以實現產業化育苗。以往的相關研究多采用嘌呤型細胞分裂素（如6-BA、KT等），但至今還未見到應用TDZ對其組培苗復壯的研究報道。筆者在兔耳風組培試驗中發現，試管苗在離體連續培養30多代后其生長增殖出現衰退，為了恢復其生長增殖能力，就TDZ的不同添加方式和不同濃度處理對其組培苗增殖系數、有效芽及苗高生長的影響情況進行了試驗研究，以期建立長久、高效的快繁體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗用外植體均取自MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養基上繼代增殖一年半以上的杏香兔耳風無菌試管苗。

1.2 方 法

1.2.1 TDZ的不同濃度處理

取繼代次數相同、株高均勻一致的杏香兔耳風單株接入以下培養基中：MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L（此為快繁試驗中篩選出的最佳培養基）和0.0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L的TDZ，復壯第一代時每個處理接種14瓶，每瓶6株，繼代周期為25 d/次。

1.2.2 激素添加方法

BA和NAA均在滅菌之前加入，TDZ是先將其pH值調至5.8，經0.2 μm的微孔濾膜抽濾滅菌后，待經121℃高壓滅菌17 min后的培養基溫度降至60～80 ℃時再加入。

1.2.3 生根培養

采用如表1的三因素二水平L4（23）正交試驗設計，其中A、B、C三因素分別代表有無經TDZ復壯（即TDZ和TDZ0）、NAA濃度（0.02和0.10 mg/L）及IBA濃度（0.02和0.10 mg/L）。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal test design

1.3 培養條件

基本培養基選用MS培養基，其蔗糖含量為30 g/L，卡拉膠6.7 g/L，pH值為5.8，培養室的溫度設為（25±2）℃，濕度為40%～70%，光周期10 h/d，光照強度1 500～2 000 Lx。

1.4 測定與數據統計

在接種30 d后，在接種的14瓶中隨機抽取6瓶進行數量和高度的統計，統計指標包括0.5～1.0 cm的芽數、＞1.0 cm的芽數、芽的增殖倍數、總芽數、根的數量，測量苗高及根的長度。

有效芽＝（0.5～1.0 cm的芽數）＋（＞1.0 cm的芽數）。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel2003軟件進行數據處理，采用SPASS16.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TDZ的添加方式對組培苗增殖生長的影響

TDZ的添加方式對組培苗增殖生長的影響情況如圖1 所示。由圖1可知，TDZ的添加均提高了組培苗的增殖系數，隨著TDZ濃度的增加，其增殖系數呈增加趨勢，且均在TDZ濃度為0.8 mg/L時達到了最大，抽濾滅菌的最大增殖系數為5.11，而高壓滅菌的最大增殖系數為4.53，與抽濾滅菌后TDZ濃度分別為0.8和1.0 mg/L的增殖系數相當；相比之下，杏香兔耳風的增殖系數，經抽濾滅菌加入TDZ的要明顯高于高壓滅菌加入TDZ的。

圖1 TDZ的添加方式對組培苗增殖生長的影響Fig. 1 Effect of added ways of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings

TDZ的添加方式對組培苗的有效芽數和苗高的影響情況如圖2 所示。由圖2可知，TDZ的添加在一定程度上能促使苗高的增長，但是，TDZ的兩種添加方式對苗高的影響并不明顯。當TDZ經高壓滅菌加入時，組培苗的有效芽個數處于持續增長的趨勢。而以抽濾滅菌方式添加TDZ后，當TDZ的濃度在0.8 mg/L時，其有效芽個數達到了最大值，隨后下降；當TDZ的濃度在1.0 mg/L時，TDZ兩種添加方式影響下的有效芽數基本持平；當TDZ的濃度在0.4～1.0 mg/L時，添加了TDZ的各處理的有效芽數均顯著（P＜0.05）高于對照（不添加TDZ）。而以另一種方式添加TDZ后，當TDZ的濃度高于0.8 mg/L時，其有效芽數才顯著（P＜0.05）高于對照。

2.2 不同濃度的TDZ對兔耳風不定芽增殖及髙生長的影響

圖2 TDZ的添加方式對組培苗有效芽數及苗高的影響Fig. 2 Effect of added ways of TDZ on effective bud number and seedling height in tissue culture seedlings

不同濃度的TDZ對兔耳風不定芽增殖及苗髙生長的影響情況如表2。試驗中發現，隨著在同一培養基中的繼續培養，不同濃度的TDZ處理的不定芽增殖系數及苗髙生長均發生了明顯的變化，繼代第3次的增殖生長已趨于穩定狀態，因此，本試驗統計的是繼代3次后的結果。表2表明，不同濃度TDZ處理的增殖系數在3.67～5.11之間，均顯著高于對照，比對照提高了1.38～1.92倍。隨著TDZ濃度的增加，其增殖系數呈先增加后降低的變化趨勢，增殖系數最高達到了5.11，顯著高于TDZ濃度分別為0.2、0.4、0.6和1.0 mg/L的各處理。

表2 不同濃度的TDZ對兔耳風不定芽增殖及苗髙生長的影響?Table 2 Effect of different concentrations of TDZ on adventitious bud proliferation and seedling height in A. fragrans

隨著TDZ濃度的增加，雖然總芽數和苗高呈升高趨勢，但是有效芽數及其所占總芽數的比率在達到一個峰值后，又有略微下降的趨勢。從芽的質量狀況來看，當TDZ的濃度達到1.0 mg/L時，苗高達到了2.84 cm，但植株莖干細弱，葉卷曲，苗木呈玻璃化狀。綜合來看，TDZ濃度在0.8 mg/L時，其苗高雖然比濃度為1.0 mg/L的TDZ處理的低，但其增殖系數、有效芽數均達到了最大值，其主莖粗壯，葉色濃綠，植株健壯，苗質量總體達到最優，使已經嚴重退化的試管苗又恢復了正常的增殖生長能力，達到了預期的復壯效果。

2.3 不同濃度的NAA和IBA對兔耳風組培苗生根的影響

以1/2MS培養基作為基本培養基，分別選取健壯、苗高＞1 cm并在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋TDZ 0.8 mg/L培養基（以下簡稱TDZ）上連續培養3代以上的試管苗和在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養基（以下簡稱TDZ0）上獲得的試管苗進行生根試驗，結果見表3。

根的質量是影響組培苗移栽成活率的關鍵因素之一。試驗中選用生根率、根長及根數這3個指標來評價杏香兔耳風根的質量，同時采用排隊評分法，將多指標轉化為單指標進行數據分析，繼而確定各項指標的優劣度和重要性。按生根率排隊，4號試驗為70%，排在最后，計1分；3號試驗為97%，最高，計10分；其他試驗號各指標值的得分視其與該指標最優值的差異按比例計分，將每號試驗的所有指標的分數相加即得綜合評分，如表4所示。由表4可知，2號試驗的綜合評分最高，即試驗條件為A1B2C2，影響因素的主次順序為C、B、A，較佳試驗處理為A2B1C2。可見，A因素的影響最小，即TDZ處理對組培苗生根的影響不大。由此得出，最優的生根培養基配方為：1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋IBA 0.1 mg/L。

表3 正交試驗結果Table 3 Result of the orthogonal test

表4 各項試驗指標的排隊評分結果和極差分析結果Table 4 Result of scoring and range analysis of each tested index

3 結論與討論

有關研究結果表明，TDZ用于西南樺[8]、桑樹[9]、黑荊樹[10]等組織培養中均可誘導芽的發生和增殖。本研究結果表明，在杏香兔耳風組織培養過程中，TDZ的添加對其不定芽的增殖具有明顯的促進作用，并且同其他植物生長調節劑一樣，具有一定的作用范圍，這種低質量濃度處理可促進生長而高質量濃度處理卻抑制生長的特性產生的原因可能是，外植體內部的內源激素與TDZ在低濃度時維持著一定的平衡狀態，而高濃度處理打破了二者的平衡，從而抑制其生長[11]。TDZ細胞分裂素活性強于6-BA，最高的增殖系數達到了5.11，要高于江香梅等人[5]研究的結果（5.05），此時組培苗的葉綠、大且伸展，苗粗壯，組培苗的質量要優于江香梅等人單獨使用6-BA培育的苗木質量，這也說明了TDZ與6-BA有很好的協同促進作用，這與陳宗禮等人[12]對棗樹的研究結果一致，其作用機理可能與TDZ可誘導細胞分裂的生物合成，抑制內源生長素的降解有關[13]。在含有TDZ的培養基中，已衰退的組培苗的增殖能力又重新得到了恢復，表現出了良好的生長態勢；在香椿的組培快繁中也有同樣的研究報道[14]。這可能與TDZ處理引起了植物組織和器官內酶動力學的改變，延緩了離體葉片的葉綠素降解速度[15]，改變了細胞膜的透性[16]等有關，從而提高了組培苗增殖能力，改善了組培苗的質量。但是，TDZ的不同添加方式對杏香兔耳風增殖的適宜濃度范圍的影響有差異，這可能與高壓滅菌影響了TDZ的活性有關。有關研究結果表明，TDZ的活性取決于其特殊結構，如果其結構被改變則其活性會降低[2]，試驗中發現，TDZ經高壓滅菌后其活性低于抽濾滅菌方式的，這可能因為高溫高壓滅菌在一定程度上破壞了TDZ的分子結構，但具體原因還需要進一步的研究。

不定芽的數量及高度均影響苗木的生根。許多研究結果都表明，低質量濃度的TDZ可誘導產生大量的叢生芽，且能促進芽的伸長；高質量濃度的TDZ雖能產生大量的不定芽，但會抑制組培苗的伸長生長[10，17]。本研究結果表明，TDZ亦能誘導產生大量的不定芽，但是有效芽的個數有所減少，且組培苗莖干纖弱，不利于后期生根。

TDZ對組培苗生根的影響因物種不同而有不同的生理效應，其用于棉花、芋等離體芽培養中有促進生根的作用[18-19]，而其對樹莓、棗樹和香椿等組培苗的生根卻有抑制作用[12,14,20]，仙客來在含有TDZ的培養基中亦不能生根[21]。本研究結果表明，在增殖培養基中添加TDZ，對后期組培苗生根的影響不大，這與其在香椿中的試驗效果一致，但其對組培苗生根的影響情況還需要進一步的試驗加以證實。

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Effects of TDZ on rejuvenation of tissue culture seedlings inAinsliaea fragrans

LI Feng-qing, YAO Jia-bao, ZENG Man-sheng, LI Yue-qiao, YUAN Ya-qi, ZHOU Xin-hua
(Experimental Center of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fenyi 336600, Jiangxi, China)

In order to learn effects of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings, the function of TDZ during rejuvenation of declining tissue culture seedlings were researched, taking declining tissue culture seedlings inAinsliaea fragransas materials. The effects of TDZ added ways (leaching sterilization and high-pressure sterilization) and TDZ concentrations (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/L) on proliferation coefficient, effective bud number and seedling height were researched. The results showed that TDZ added ways had bigger effects on proliferation coefficient and effective bud number when TDZ concentration was over 0.2 mg/L, and proliferation coefficient and effective bud number in the leaching sterilization treatment were obviously higher than those in the high-pressure sterilization treatment. The effects of different concentrations of TDZ on effective bud number and seedling height had significant differences (P＜0.01).When TDZ concentration was 0.8 mg/L, the seedlings had the best quality, proliferation coefficient was 5.11, and the expectant rejuvenation effect was obtained. The optimal rooting medium was 1/2MS+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.1 mg/L. In the rejuvenation process of tissue culture seedlings inA. fragrans, TDZ could be used as an effective plant growth regulator.

Ainsliaea fragransChamp; TDZ; tissue culture; proliferation; rejuvenation

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.020 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-08-18

中國林業科學研究院基本科研業務費專項基金項目（CAFYBB2012002）。

李峰卿，工程師，博士研究生。E-mail：lfqnjfu@163.com

李峰卿,姚甲寶,曾滿生,等. TDZ對杏香兔耳風組培苗復壯的影響[J].經濟林研究,2015,33(3):112－115,125.

S603

A

1003—8981(2015)03—0112—04

[本文編校：伍敏濤]